Универсальное редактирование генома CRISPR: метод направленного восстановления генов на основе гомологии в культивируемых клетках с использованием системы CRISPR-Cas9

Аннотация

Источник: Zhang, L. et al, Выбивание гена с помощью CRISPR/Cas9 и сортировка клеток в линиях макрофагов и Т-клеток. J. vis. Exp. (2021).

В этом видео мы демонстрируем универсальное редактирование генома на основе CRISPR-Cas9 в культивируемых клетках, где Cas9 и sgRNA предоставляются клеткам как единая плазмидная конструкция. Система CRISPR-Cas9 и желаемый ген, который должен был быть вставлен, были введены в клетки с помощью техники электропорации для облегчения успешного редактирования генов.

Протокол

1. Электропорация линий макрофагов и Т-клеток

1. Подготовка клеточных культур к электропорации
   1. Приготовьте препарат Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в качестве полноценной питательной среды для Т-клеток Jurkat. Приготовьте модифицированную среду Dulbecco Eagle Medium (DMEM) с 10% FBS для культивирования макрофагов RAW264.7. Добавляйте все полноценные питательные среды со 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Pen/Strep), за исключением сред, используемых для инкубации после трансфекции перед сортировкой клеток.
   2. Выполнить субкультивирование RAW264.7 и Jurkat T клеток в соответствии с инструкциями поставщика (см. Таблицу материалов). При субкультивировании клеток RAW264.7 используйте раствор трипсина-ЭДТА (0,25%) для отделения клеток. Используйте FBS с добавлением 10% (v/v) ДМСО в качестве среды для криоконсервации клеток RAW264.7 и Jurkat.
   3. Соберите клетки по 250 × г в течение 5 мин для макрофагов RAW264.7 и 90 × г в течение 8 мин для Т-клеток Jurkat. Затем умывайтесь 5-10 мл 1× DPBS (без ионов Ca²⁺ или Mg²⁺). Снимите DPBS.
   4. Повторно суспендируйте клеточную гранулу, используя 2 мл 1× DPBS. Используйте 10 μл клеток и смешайте с равным объемом 0,2% трипанового синего для оценки количества клеток и жизнеспособности.
      заметка: Убедитесь, что культура клеток имеет жизнеспособность >90% в день трансфекции.
   5. Для одного эксперимента с выбиванием выполните электропорацию с помощью наконечников нуклеофекции объемом 10 мкл с пятью повторениями. Рассчитайте объем, необходимый для 2,0 × 106 ячеек, и гранулируйте ячейки центрифугированием. Снова промойте гранулу ячейки 1× DPBS, как описано в шаге 1.1.2.
      заметка: При использовании нуклеофекционных наконечников объемом 10 мкл на одну электропорацию требуется 4,0 × 10⁵ клеток. Соответственно, подготовьте не менее 2,0 × 10⁶ клеток для одного нокаут-ин-эксперимента.
   6. Приготовьте 24-луночный планшет с 0,5 мл полной питательной среды (приготовленной на шаге 1.1.1) на лунку без Pen/Strep и предварительно прогрейте в инкубаторе при температуре 37 °C.

2. Электропорация компонентов CRISPR/Cas9 и вектор нацеливания

1. Включите систему электропорации. Используйте следующие оптимизированные параметры электропорации: 1400 В/20 мс/2 импульса для макрофагов RAW264.7 и 1350 В/20 мс/2 импульса для Т-клеток Jurkat.
2. Учитывая потерю пробы из-за пипетирования, приготовьте электропорационную смесь объемом 55 мкл в стерильной микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл, содержащей по 2,5 мкг каждого вектора CRISPR/Cas9 (pDsR-mR26-sg1 и pDsR-mR26-sg2 для нокаутирования локуса mRosa26, и pDsR-hR26-sg1 и pDsR-hR26-sg2 для локуса hROSA26), 2,4 мкг линеаризоватого вектора нацеливания (pKR26-POI-iBFP или pKhR26-POI-iBFP для mRosa26 и hROSA26выбивной, линеаризованный EcoRI или BamHI) и буфер для ресуспендирования R.
   заметка: Для экономии времени электропорационную смесь можно приготовить во время центрифугирования (шаг 1.1.5).
3. Ресуспендируйте 2,0 × 10⁶ элементов (приготовленных на шаге 1.1.5) в электропорационную смесь объемом 55 мкл с шага 1.2.2.
4. Аспирируйте смесь клетки/электропорации с шага 1.2.3 с помощью наконечника для нуклеофекции объемом 10 мкл с помощью пипетки.
   заметка: Во время пипетирования избегайте попадания пузырьков воздуха, которые могут привести к сбою электропорации.
5. Добавьте образец в пробирку, заполненную 3 мл буфера E из набора для электропорации.
6. Примените параметры электропорации для двух типов ячеек, как описано в шаге 1.2.1.
7. Перенесите образец в одну лунку 24-луночного планшета с предварительно подогретой средой с шага 1.1.6.
8. Повторите шаги 1.2.4-1.2.7 для остальных четырех повторений, а также для элементов управления только вектором нацеливания и только вектором экспрессии CRISPR.
   заметка: Измените наконечник и трубку нуклеофекции при переключении на другой тип клеток/плазмидную ДНК.
9. Культивируйте трансфицированные клетки в течение 48-72 ч для обеспечения восстановления после электропорации и экспрессии компонентов CRISPR/Cas9 перед анализом проточной цитометрии или флуоресцентно-активируемой сортировкой клеток (FACS).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Ампициллин, натриевая соль	MP Biomedicals	194526
Cellometer Mini Автоматизированный счетчик ячеек	Nexcelom Bioscience
DPBS (10X), без кальция, без магния	ThermoFisher Scientific	14200075
Модифицированная орлиная среда Дульбекко (DMEM) с высоким содержанием глюкозы	ГиКлон	SH30022.01
Falcon 5 мл пробирка с круглым дном из полистирола	BD Biosciences	352003
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	ThermoFisher Scientific	10099141
Юркат	АТКС	ТИБ-152	https://www.atcc.org/
Канамицина сульфат	MP Biomedicals	194531
Многоканальный пипетка (30-300 μл)	Eppendorf, или аналогичный
Неоновая трансфекционная система	ThermoFisher Scientific	MPK5000
Неоновая трансфекционная система, набор 10 μл	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Nunc 15 мл конические стерильные центрифужные пробирки	ThermoFisher Scientific	339651
Наконечник для пипетки 0,1-20 мкл	Eppendorf, или аналогичный	0030 075.005 (Английский
Наконечник для пипетки 2-200 мкл	Eppendorf, или аналогичный	0030 075.021
Наконечник для пипетки 50-1000μл	Eppendorf, или аналогичный	0030 075.064
pX458-DsRed2	Адджен	112219
RAW264.7	АТКС	ТИБ-71	https://www.atcc.org/
RPMI 1640 Средний	ГиКлон	SH30027.01
Пенициллин-стрептомицин	ThermoFisher Scientific	15140122
Раствор трипана синего, 0,4%	ThermoFisher Scientific	15250061
1,5 мл микропробирок, ПЦР-чистый	Eppendorf, или аналогичный	0030 125.215
24-луночные многолуночные планшеты с прозрачным покрытием TC	Корнинг	No 3524

)