Редактирование генома на основе нуклеазы цинковых пальцев: метод модификации генома в плюрипотентных стволовых клетках человека с помощью механизма репарации, зависящей от двухцепочечной гомологии

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Подготовка стволовых клеток к редактированию

1. Выращивайте и культивируйте человеческие плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) на 6-луночной пластине, содержащей 2,4 × 10⁶ клеток/планшет митомицина C-инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов (MEF), выращенных на желатине. Поддерживайте hPSCs в 3 мл среды для эмбриональных стволовых клеток человека на лунку (среды hESC) и выращивайте в инкубаторе при температуре 37 °C с 3% O_{, 2}/5% CO₂,
   заметка: Для успеха этого протокола не обязательно поддерживать ПСК в инкубаторе с низким содержанием кислорода; однако важно отметить, что hPSCs размножаются быстрее в среде с высоким содержанием_O2, поэтому время и количество клеток должны быть скорректированы соответствующим образом. Следует также отметить, что hPSCs, поддерживаемые при низком содержании кислорода, имеют более низкие показатели спонтанной дифференцировки.
   1. Чтобы получить 500 мл среды hESC, смешайте 380 мл DMEM/F12, 75 мл фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS), 25 мл заменительной сыворотки KnockOut (KSR). Добавьте глютамин (конечная концентрация 1 мМ), 5 мл 100 заменимых аминокислот, 100 единиц/мл пенициллин-стрептомицина (P/S), основной фактор роста фибробластов (bFGF) (конечная концентрация 4 нг/мл) и 2-меркаптоэтанол (конечная концентрация 5,5 μM).
2. Смените носитель, удалив весь объем носителя (3 мл) с помощью стеклянной пипетки и пропылесоса. Замените 3 мл теплой среды hESC с помощью серологической пипетки. Повторяйте смену среды каждый день до тех пор, пока уровень hPSCs не станет примерно на 50% конфлюентным (День-1).
3. За сутки до таргетинга (День-1) смените среду hESC, удалив старую среду и добавив теплую среду hESC с добавлением 10 μM Y-27632.
4. Также в день -1 приготовьте одну-две 6-луночные или 10-сантиметровые пластины лекарственно-устойчивых клеток MEF-фидера от мышей DR4 (2,4 × 10⁶ клеток/планшет).
   Примечание: В целом, 6-луночные планшеты имеют преимущество перед 10-сантиметровыми, так как они вмещают больше сред. Планшеты с 6 лунками также гарантируют, что различные клоны из разных лунок являются независимыми. Тем не менее, пластина длиной 10 см позволит легче собирать данные, в зависимости от микроскопа, доступного для этого процесса.

2. Редактирование плюрипотентных стволовых клеток

1. Приготовьте трансфекционные растворы, пипетируя по 5 мкг ZFN 1 и 2 (рис. 1) в пробирку объемом 1,5 мл. Также пипеткой введите 30 г восстановительной плазмиды в эту пробирку. Наконец, внесите в пробирку 1x фосфатно-солевой буфер (PBS), чтобы довести объем до 300 μл.
   заметка: Готовят плазмиды в виде мидипрепа (подойдет любой набор) с минимальной концентрацией 300 нг/мкл, чтобы общий объем трансфекционного раствора не превышал 300 мкл. Нет необходимости проводить экстракцию фенолом/хлороформом, линеаризировать плазмиду или использовать набор для подготовки плазмиды, не содержащей эндотоксинов.
2. Удалите среду из hPSC с помощью стеклянной пипетки и пропылесосите. Пипетка 2 мл подогрейте 1x PBS в каждую лунку, чтобы промыть клетки.
3. Немедленно извлеките PBS с помощью стеклянной пипетки и пропылесосите. Добавьте 0,5 мл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА непосредственно на клетки в каждой лунке. Поместите в инкубатор (37 °C/5% CO,₂/3%_O2) примерно на 10 минут или до тех пор, пока слой кормушки не начнет отрываться от пластины.
4. Добавьте 2 мл теплой среды esWash (470 мл DMEM/F12, 25 мл FBS, 100 единиц/мл P/S) в каждую лунку, чтобы остановить реакцию трипсина.
5. Следите за тем, чтобы подающие ячейки оторвались как лист. Пипеткой наденьте содержимое каждой лунки в одну коническую пробирку объемом 50 мл, объединив все лунки. Растирайте клетки с помощью серологической пипетки объемом 10 мл. Не стоит разбивать подающий слой; ПСК будут отделяться от питающего слоя путем осторожного растирания. На нее должно приходиться около 15 мл клеточной суспензии.
6. Добавьте в тюбик 25 мл фильтрующего материала esWash, чтобы довести общий объем до 40 мл. Дайте большим кускам кормушки осесть на дне трубки в течение 1-2 минут. Удалите надосадочную жидкость (~38 мл) из пробирки с помощью серологической пипетки и поместите в новую коническую пробирку объемом 50 мл.
7. Отжимайте в течение 5 мин при 190 x g. Удалите надосадочную жидкость из пробирки с помощью стеклянной пипетки и пропылесосите. Следите за тем, чтобы не тревожить клеточную гранулу. Ресуспендируйте элементы в 500 мкл 1x PBS. Соедините с плазмидным раствором для трансфекции, приготовленным ранее. Подсчитайте ячейки на этом шаге. Используйте 5-10 миллионов ячеек на одну электропорацию.
8. Пипеткой всю суспензию объемом 800 мкл поместить в электропорационную кювету диаметром 4 мм, поместить на лед на 3-5 мин. Электропорировать ячейки с помощью экспоненциальной программы на системе электропорации со следующими параметрами: 250 В, 500 мкФ, сопротивление ∞ и размер кюветы 4 мм. После электропорации поставьте кювету обратно на лед на 3 мин.<бр/> заметка: Следите за постоянной времени электропорации на системе электропорации. Постоянная времени изменяется в зависимости от количества клеток и чистоты ДНК. Успешные трансфекции обычно имеют постоянную времени в пределах 10-14 мсс при использовании перечисленных условий и генного генератора II. Более низкая эффективность электропорации может произойти, когда временные константы отклоняются от этих значений.
9. Ресуспендируйте электропорированные элементы в теплой среде hESC объемом 18 мл с добавлением 10 мкМ Y-27632. Поместите 3 мл этой одноклеточной суспензии в каждую лунку 6-луночного планшета с питательными ячейками DR4. Возврат в инкубатор (37 °C/5% CO₂/3%_O2).

3. Отбор положительных колоний

1. На 2-й день удалите все носители с помощью стеклянной пипетки и пропылесосьте. Замените на 3 мл теплой среды hESC с добавлением 10 мкМ Y-27632. День 3, удалите все среды с помощью стеклянной пипетки и пропылесосьте. Замените 3 мл теплого фильтрующего материала hESC без Y-27632. День 4, удалите все носители с помощью стеклянной пипетки и пропылесосите. Замените 3 мл теплой среды hESC с добавлением антибиотиков для выбора. Возврат в инкубатор (37 °C/5% CO₂/3% O₂).
   заметка: Тип используемого антибиотика будет зависеть от стойкости кассеты, входящей в шаблон для ремонта. При работе с WIBR#3 hPSCs (реестр NIH 0079) успешно использовались 0,5 мкг/мл пуромицина, 70 мкг/мл G418 (geneticin) и 35 мкг/мл гигромицина. Концентрации для отбора должны быть определены эмпирически путем установления минимальной концентрации антибиотика, необходимой для уничтожения клеток дикого типа в течение примерно одной недели.
2. Дни 5-12, ежедневно меняйте среды, каждый раз заменяя старые среды на теплые среды hESC с добавлением антибиотиков.
   заметка: Ожидайте большого количества гибели клеток. Отдельные колонии станут заметны примерно на 8-10 день. Обычные среды hESC без антибиотиков можно использовать через 12-14 дней непрерывного отбора. Если плотность клеток высока или гибель клеток происходит медленно, следует избегать подкисления среды и может потребоваться увеличение объема среды (до 4-5 мл) в течение первых нескольких дней отбора.

Рисунок 1. Схема отредактированного гена локуса AAVS1 с использованием шаблона репарации AAV-CAGGS-EGFP. Модифицировано по Hockemeyer et al., 2009.