Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка стволовых клеток к редактированию
- Выращивайте и культивируйте человеческие плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) на 6-луночной пластине, содержащей 2,4 × 106 клеток/планшет митомицина C-инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов (MEF), выращенных на желатине. Поддерживайте hPSCs в 3 мл среды для эмбриональных стволовых клеток человека на лунку (среды hESC) и выращивайте в инкубаторе при температуре 37 °C с 3% O, 2/5% CO2,
заметка: Для успеха этого протокола не обязательно поддерживать ПСК в инкубаторе с низким содержанием кислорода; однако важно отметить, что hPSCs размножаются быстрее в среде с высоким содержаниемO2, поэтому время и количество клеток должны быть скорректированы соответствующим образом. Следует также отметить, что hPSCs, поддерживаемые при низком содержании кислорода, имеют более низкие показатели спонтанной дифференцировки.
- Чтобы получить 500 мл среды hESC, смешайте 380 мл DMEM/F12, 75 мл фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS), 25 мл заменительной сыворотки KnockOut (KSR). Добавьте глютамин (конечная концентрация 1 мМ), 5 мл 100 заменимых аминокислот, 100 единиц/мл пенициллин-стрептомицина (P/S), основной фактор роста фибробластов (bFGF) (конечная концентрация 4 нг/мл) и 2-меркаптоэтанол (конечная концентрация 5,5 μM).
- Смените носитель, удалив весь объем носителя (3 мл) с помощью стеклянной пипетки и пропылесоса. Замените 3 мл теплой среды hESC с помощью серологической пипетки. Повторяйте смену среды каждый день до тех пор, пока уровень hPSCs не станет примерно на 50% конфлюентным (День-1).
- За сутки до таргетинга (День-1) смените среду hESC, удалив старую среду и добавив теплую среду hESC с добавлением 10 μM Y-27632.
- Также в день -1 приготовьте одну-две 6-луночные или 10-сантиметровые пластины лекарственно-устойчивых клеток MEF-фидера от мышей DR4 (2,4 × 106 клеток/планшет).
Примечание: В целом, 6-луночные планшеты имеют преимущество перед 10-сантиметровыми, так как они вмещают больше сред. Планшеты с 6 лунками также гарантируют, что различные клоны из разных лунок являются независимыми. Тем не менее, пластина длиной 10 см позволит легче собирать данные, в зависимости от микроскопа, доступного для этого процесса.
2. Редактирование плюрипотентных стволовых клеток
- Приготовьте трансфекционные растворы, пипетируя по 5 мкг ZFN 1 и 2 (рис. 1) в пробирку объемом 1,5 мл. Также пипеткой введите 30 г восстановительной плазмиды в эту пробирку. Наконец, внесите в пробирку 1x фосфатно-солевой буфер (PBS), чтобы довести объем до 300 μл.
заметка: Готовят плазмиды в виде мидипрепа (подойдет любой набор) с минимальной концентрацией 300 нг/мкл, чтобы общий объем трансфекционного раствора не превышал 300 мкл. Нет необходимости проводить экстракцию фенолом/хлороформом, линеаризировать плазмиду или использовать набор для подготовки плазмиды, не содержащей эндотоксинов.
- Удалите среду из hPSC с помощью стеклянной пипетки и пропылесосите. Пипетка 2 мл подогрейте 1x PBS в каждую лунку, чтобы промыть клетки.
- Немедленно извлеките PBS с помощью стеклянной пипетки и пропылесосите. Добавьте 0,5 мл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА непосредственно на клетки в каждой лунке. Поместите в инкубатор (37 °C/5% CO,2/3%O2) примерно на 10 минут или до тех пор, пока слой кормушки не начнет отрываться от пластины.
- Добавьте 2 мл теплой среды esWash (470 мл DMEM/F12, 25 мл FBS, 100 единиц/мл P/S) в каждую лунку, чтобы остановить реакцию трипсина.
- Следите за тем, чтобы подающие ячейки оторвались как лист. Пипеткой наденьте содержимое каждой лунки в одну коническую пробирку объемом 50 мл, объединив все лунки. Растирайте клетки с помощью серологической пипетки объемом 10 мл. Не стоит разбивать подающий слой; ПСК будут отделяться от питающего слоя путем осторожного растирания. На нее должно приходиться около 15 мл клеточной суспензии.
- Добавьте в тюбик 25 мл фильтрующего материала esWash, чтобы довести общий объем до 40 мл. Дайте большим кускам кормушки осесть на дне трубки в течение 1-2 минут. Удалите надосадочную жидкость (~38 мл) из пробирки с помощью серологической пипетки и поместите в новую коническую пробирку объемом 50 мл.
- Отжимайте в течение 5 мин при 190 x g. Удалите надосадочную жидкость из пробирки с помощью стеклянной пипетки и пропылесосите. Следите за тем, чтобы не тревожить клеточную гранулу. Ресуспендируйте элементы в 500 мкл 1x PBS. Соедините с плазмидным раствором для трансфекции, приготовленным ранее. Подсчитайте ячейки на этом шаге. Используйте 5-10 миллионов ячеек на одну электропорацию.
- Пипеткой всю суспензию объемом 800 мкл поместить в электропорационную кювету диаметром 4 мм, поместить на лед на 3-5 мин. Электропорировать ячейки с помощью экспоненциальной программы на системе электропорации со следующими параметрами: 250 В, 500 мкФ, сопротивление ∞ и размер кюветы 4 мм. После электропорации поставьте кювету обратно на лед на 3 мин.<бр/>
заметка: Следите за постоянной времени электропорации на системе электропорации. Постоянная времени изменяется в зависимости от количества клеток и чистоты ДНК. Успешные трансфекции обычно имеют постоянную времени в пределах 10-14 мсс при использовании перечисленных условий и генного генератора II. Более низкая эффективность электропорации может произойти, когда временные константы отклоняются от этих значений.
- Ресуспендируйте электропорированные элементы в теплой среде hESC объемом 18 мл с добавлением 10 мкМ Y-27632. Поместите 3 мл этой одноклеточной суспензии в каждую лунку 6-луночного планшета с питательными ячейками DR4. Возврат в инкубатор (37 °C/5% CO2/3%O2).
3. Отбор положительных колоний
- На 2-й день удалите все носители с помощью стеклянной пипетки и пропылесосьте. Замените на 3 мл теплой среды hESC с добавлением 10 мкМ Y-27632. День 3, удалите все среды с помощью стеклянной пипетки и пропылесосьте. Замените 3 мл теплого фильтрующего материала hESC без Y-27632. День 4, удалите все носители с помощью стеклянной пипетки и пропылесосите. Замените 3 мл теплой среды hESC с добавлением антибиотиков для выбора. Возврат в инкубатор (37 °C/5% CO2/3% O2).
заметка: Тип используемого антибиотика будет зависеть от стойкости кассеты, входящей в шаблон для ремонта. При работе с WIBR#3 hPSCs (реестр NIH 0079) успешно использовались 0,5 мкг/мл пуромицина, 70 мкг/мл G418 (geneticin) и 35 мкг/мл гигромицина. Концентрации для отбора должны быть определены эмпирически путем установления минимальной концентрации антибиотика, необходимой для уничтожения клеток дикого типа в течение примерно одной недели.
- Дни 5-12, ежедневно меняйте среды, каждый раз заменяя старые среды на теплые среды hESC с добавлением антибиотиков.
заметка: Ожидайте большого количества гибели клеток. Отдельные колонии станут заметны примерно на 8-10 день. Обычные среды hESC без антибиотиков можно использовать через 12-14 дней непрерывного отбора. Если плотность клеток высока или гибель клеток происходит медленно, следует избегать подкисления среды и может потребоваться увеличение объема среды (до 4-5 мл) в течение первых нескольких дней отбора.
