TALEN-опосредованная интеграция целевых генов: использование сконструированных последовательно-специфичных нуклеаз для точной вставки гена флуоресцентного белка в гиПСК

Abstract

Источник: Cerbini, T. et al. Трансфекция, отбор и выбор колоний индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, нацеленных на TALEN с геном GFP, в безопасную гавань AAVS1. J. Vis. Exp. (2015)

Это видео описывает точную технику редактирования генома в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках человека, или hiPSCs, с использованием TALEN для создания двухцепочечных разрывов в целевом локусе, индуцируя направленную на гомологию репарацию для интеграции генов флуоресцентного белка.

Protocol

1. Подготовка матрицы базальной мембраны и нанесение покрытия на пластиковые изделия

1. Поместите замороженный материал матрицы базальной мембраны при температуре -20 °C на лед и разморозьте в течение ночи при температуре 4 °C.
2. После размораживания пипеткой 2 мг аликвот матрицы базальной мембраны в предварительно охлажденные пробирки Эппендорфа. Храните их при температуре -20 °C до тех пор, пока они не понадобятся.
3. Для приготовления пластин с матричным покрытием базальной мембраны размораживайте одну аликвоту на льду до тех пор, пока последний кусочек льда в трубке Эппендорфа не исчезнет (обычно в течение ~2 часов).
4. После размораживания добавьте матрицу базальной мембраны в 12 мл холодного (4 °C) DMEM/F12, чтобы получить раствор для покрытия матрицы базальной мембраны.
5. Добавьте раствор базальной мембраны в соответствующий питательный сосуд. Для планшета на 6 лунок выдайте 1 мл на лунку. Поверните пластину, чтобы убедиться, что матричный раствор базальной мембраны полностью покрывает каждую лунку.
6. Парапленкой запечатайте пластину/чашку с матричным покрытием базальной мембраны и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 часа перед использованием. В качестве альтернативы можно хранить тарелки/посуду с матричным покрытием цокольной мембраны при температуре 4 °C и использовать в течение 2 недель после нанесения покрытия.
   заметка: Добавьте дополнительное количество DMEM/F12 на тарелку/чашку с матричным покрытием цокольной мембраны, чтобы предотвратить высыхание. Перед использованием хранящейся тарелки/чашки с матричным покрытием при температуре 4 °C поместите ее в шкаф биологической безопасности и дайте ей нагреться до комнатной температуры не менее 30 минут.
7. Аспират базальной мембраны матрикс полностью перед добавлением среды и клеток.

2. Приготовление среды E8

1. Приготовьте питательную среду Е8, разморозив добавку Е8 в течение ночи при 4 °С.
2. Удалите 10 мл базальной среды Е8 из бульона объемом 500 мл и выбросьте.
3. Пипеткой весь флакон объемом 10 мл добавки Е8 непосредственно в 490 мл базальной среды Е8. Не нагревайте полную среду E8 на водяной бане при температуре 37 °C, так как повторяющиеся колебания температуры могут привести к ухудшению bFGF в полной среде E8.
4. Используйте полную среду E8 в течение 2 недель после добавления добавки.

3. Размораживание iPSC

1. Извлеките пузырек с замороженным ИПСК из жидкого азота и положите на сухой лед.
2. Быстро разморозьте флакон на водяной бане при температуре 37 °C; вращайте флакон на водяной бане, пока не останется лишь крошечный фрагмент льда.
3. Опрыскайте флакон 70% этанолом и переложите в шкаф биологической безопасности.
4. Добавьте 1 мл среды комнатной температуры Е8 по каплям непосредственно во флакон.
5. С помощью пипетки объемом 2 мл перенесите клеточную суспензию по каплям в 9 мл среды Е8 в конической пробирке объемом 15 мл. Часто вращайте пробирку, чтобы убедиться, что клетки и среда быстро перемешаются.
6. Центрифугируйте клетки при 200 x g в течение 5 минут.
7. Отсадите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в соответствующем объеме Е8 с добавлением 10 мкМ Y-27632.
8. Добавьте ячейки в соответствующее количество лунок с матричным покрытием базальной мембраны и поместите в инкубатор с температурой 37 °C и 5% CO₂ на ночь. Рекомендуется наносить не менее 0,2 x 10⁶ iPSC на лунку 6-луночного планшета для обеспечения быстрого восстановления после размораживания.

4. Обслуживание и регулярное прохождение iPSC

1. Обновляйте средний E8 ежедневно.
2. Контролируйте морфологию и слияние клеток с помощью инвертированного микроскопа. ИПСК высокого качества растут плоскими колониями с четкими границами; отдельные колонии имеют «булыжный» вид.
3. Проходите клетки iPSCs, когда они достигают ~70% конфлюенции.
4. Приготовьте раствор для пассирования ЭДТА, добавив 0,9 г NaCl и 500 мкл 0,5 М ЭДТА к 500 мл DPBS. Хорошо перемешайте, чтобы растворить NaCl, и вакуумируйте для стерилизации. Перед пассированием нагрейте аликвоту раствора для пассации на водяной бане при температуре 37 °C.
5. Для прохождения необходимо аспирировать отработанную питательную среду и промыть клетки однократно равным объемом теплого раствора для пропускания. Аспиратом и пипеткой достаточно раствора для пропускания ЭДТА, чтобы покрыть клетки (1 мл на лунку 6-луночного планшета).
6. Поместите клетки под перевернутый микроскоп и понаблюдайте за колониями iPSC. Появление отверстий внутри колоний и приподнятых границ должно стать очевидным в течение 2-5 минут.
7. Осторожно отсасывайте раствор для пассирования ЭДТА.
8. С помощью пипетки объемом 10 мл нанесите 4 мл среды E8 (при использовании 6-луночного планшета) под высоким давлением непосредственно в каждую лунку, которую необходимо пропустить.
9. Соберите скопления iPSC и разбейте их на соответствующее количество лунок в зависимости от коэффициента разделения от 1:8 до 1:12. Не переусердствуйте с пипеткой, так как дезагрегация клеточных скоплений приведет к снижению жизнеспособности.
10. Поместите планшет в инкубатор и покачивайте планшет вперед-назад и из стороны в сторону несколько раз, чтобы рассеять клетки.

5. Подготовка MEF и iPSCs к трансфекции

1. За 48 часов до трансфекции введите ИПСК в соотношении ~1:6 в четыре или более лунок 6-луночного планшета, покрытого матрицей базальной мембраны, так что через два дня они будут слиты на 70%.
2. На следующий день разморозьте DR4 MEF в среду MEF, состоящую из DMEM (с высоким содержанием глюкозы) с добавлением 10% FBS и 1x MEM-NEAA.
3. Поместите DR4 MEF в две 10-сантиметровые чашки при температуре ~ 2 x 10⁴ клеток/см² и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.
4. В день трансфекции смените среду MEF на E8 с добавлением 10 мкМ Y-27632 за 30 мин до проведения трансфекции на iPSCs.
5. Дополнительно: за 4 часа до трансфекции дополните культуру iPSC Y-27632 в конечной концентрации 10 μM.

6. Обработка реагентами с щадящей диссоциацией клеток и трансфекция ИПСК с использованием системы электропорации

1. Удалите раствор для трансфекции первичных клеток P3 с 4 °C и дайте ему нагреться до комнатной температуры в течение ~30 мин. Добавьте всю добавку объемом 100 мкл в раствор для трансфекции перед использованием.
2. Теплый реагент для диссоциации мягких клеток на водяной бане при температуре 37 °C.
3. Получить доноры AAVS1 TALEN (pZT-AAVS1-L1 и pZT-AAVS1-R1) и донора AAVS1-CAG-EGFP при температуре -20 °C.
4. Извлеките иПСК из инкубатора и один раз промойте DPBS.
5. Добавьте 1 мл реагента для щадящей диссоциации клеток в лунку и инкубируйте иПСК при 37 °C в течение 5 мин или до тех пор, пока более 50% клеток не диссоциируют из питательного сосуда.
6. Пипеткой вверх и вниз несколько раз с помощью пипетки p1000 для диссоциации любых оставшихся клеток из питательного сосуда и для разрушения скоплений iPSC.
7. Добавьте 2 мл среды E8 в каждую лунку и несколько раз пипетка вверх и вниз с помощью пипетки объемом 10 мл для дальнейшего разделения клеточных групп на отдельные клетки.
   заметка: Эффективность трансфекции значительно снижается, если клеточные скопления недостаточно дезагрегированы.
8. Соберите иПСК в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 100 x g в течение 3 минут.
9. Асасировать надосадочную жидкость и ресуспендировать клетки в минимальном количестве среды Е8.
10. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра после нанесения жизненно важного красителя, например, 0,4% трипанового синего. Следите за тем, чтобы клетки были достаточно диссоциированы во время подсчета (1-3 клетки на «сгусток»).
11. Распределите по 3 x 10⁶ ячейки в каждую из двух конических пробирок по 15 мл и снова поверните вниз при 100 x g в течение 3 мин.
    заметка: Низкоскоростное центрифугирование снижает нагрузку на ячейку и позволяет легко повторно суспендировать иПСК перед электропорацией.
12. Настройте систему электропорации на программу, специфичную для типа клеток для линии эмбриональных стволовых клеток человека H9 (программа CB-150).
13. После центрифугирования аспирируйте надосадочную жидкость из клеточных гранул. К одной грануле добавьте 10 мкг донора HR в качестве контрольного образца. К другой грануле добавляют 10 мкг донора HR вместе с 5 мкг каждого TALEN (pZT-AAVS1-L1 и pZT-AAVS1-R1) в качестве экспериментального образца.
14. Повторно суспендируйте каждую клеточную гранулу в 100 μл раствора для первичной трансфекции клеток P3 и перенесите в кювету.
15. Проведите трансфекцию и сразу же добавьте в каждую кювету 500 мкл среды Е8 комнатной температуры.
16. Переложите трансфицированные ИПСК по каплям в одну 10-сантиметровую чашку, содержащую DR4 MEF, приготовленную на шаге 5.4.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Матрица базальной мембраны, *LDEV-Free, 10 мл	Корнинг	354230 (Английский	Хранить при температуре -20 °C.
ДМЭМ/Ф-12	Технологии Life	11320-033	Хранить при температуре 4 °C.
Costar 6 Well Clear TC-обработанные многолуночные планшеты	Корнинг	No 3506
Essential 8 Средний	Технологии Life	A1517001	Хранить базальную среду при температуре 4 °C. Хранить добавку при температуре -20 °C.
Y-27632 дигидрохлорид	Токрис	1254	Хранить при комнатной температуре. После растворения в H2O хранить при температуре -20 °C.
Хлорид натрия	сигма	С5886-500Г
UltraPure 0,5 М ЭДТА, pH 8,0	Технологии Life	15575-020
DPBS, без кальция, без магния	Технологии Life	14190-250
100 мм Чашка для культур, обработанная TC	Корнинг	430167
DR4 MEF 2M IRR - Академический	ГлобалСтем	GSC-6204G	Хранить в жидком азоте.
ДМЭМ, высокий уровень глюкозы, пируват	Технологии Life	11995-040 Номер 11995-040	Хранить при температуре 4 °C.
Определенная фетальная бычья сыворотка, происхождение из США	ГиКлон	SH30070.03	Хранить при температуре -20 °C. Разморозить при 4 °C в течение ночи и аликвотировать. Хранить аликвоты при температуре -20 °C до тех пор, пока они не понадобятся.
Раствор заменимых аминокислот MEM (100X)	Технологии Life	11140-050	Хранить при температуре 4 °C.
4D-нуклеофекторный блок ядра	Лонза	ААФ-1001Б	Входит в состав системы электропорации.
4D-аппарат Nucleofector X	Лонза	ААФ-1001Х	Входит в состав системы электропорации.
P3 Первичная клетка 4D-нуклеофектор X Kit L (24 РКИ)	Лонза	В4ХП-3024	По прибытии удалите первичный клеточный раствор, добавьте добавку и храните при температуре 4 °C.
Реагент для диссоциации клеток аккутазы StemPro	Технологии Life	A1110501	Хранить при температуре -20 °C. Разморозьте на ночь при 4 °C и нагрейте аликвоту на водяной бане при температуре 37 °C перед использованием.
NutriStem XF/FF питательная среда	Стемгент	01-2005	Хранить при температуре -20 °C. Разморозить на ночь при 4 °C
TALENs AAVS1 (pZT-AAVS1-L1 и pZT-AAVS1-R1)	Адджен	52637 и 52638
AAVS1-CAG-EGFP Гомологичный рекомбинационный донор	Адджен	No 22212
Пуромицина дигидрохлорид	Технологии Life	А11138-03	Хранить при -20 °С. Приготовьте рабочие аликвоты 1 мг/мл в ddH2O.
Одноразовые пипетки Пастера из боросиликатного стекла	Научный центр Фишера	13-678-20А
Sorvall Legend XTR (Охлаждаемый), 120 В 60 Гц	Термо Сайентиал	75-004-521 (Английский
TX-750 4 × 750 мл Ротор с качающимся ведром	Термо Сайентиал	75003607
Раствор трипана синего, 0,4%	Технологии Life	15250-061