1. Подготовка матрицы базальной мембраны и нанесение покрытия на пластиковые изделия
- Поместите замороженный материал матрицы базальной мембраны при температуре -20 °C на лед и разморозьте в течение ночи при температуре 4 °C.
- После размораживания пипеткой 2 мг аликвот матрицы базальной мембраны в предварительно охлажденные пробирки Эппендорфа. Храните их при температуре -20 °C до тех пор, пока они не понадобятся.
- Для приготовления пластин с матричным покрытием базальной мембраны размораживайте одну аликвоту на льду до тех пор, пока последний кусочек льда в трубке Эппендорфа не исчезнет (обычно в течение ~2 часов).
- После размораживания добавьте матрицу базальной мембраны в 12 мл холодного (4 °C) DMEM/F12, чтобы получить раствор для покрытия матрицы базальной мембраны.
- Добавьте раствор базальной мембраны в соответствующий питательный сосуд. Для планшета на 6 лунок выдайте 1 мл на лунку. Поверните пластину, чтобы убедиться, что матричный раствор базальной мембраны полностью покрывает каждую лунку.
- Парапленкой запечатайте пластину/чашку с матричным покрытием базальной мембраны и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 часа перед использованием. В качестве альтернативы можно хранить тарелки/посуду с матричным покрытием цокольной мембраны при температуре 4 °C и использовать в течение 2 недель после нанесения покрытия.
заметка: Добавьте дополнительное количество DMEM/F12 на тарелку/чашку с матричным покрытием цокольной мембраны, чтобы предотвратить высыхание. Перед использованием хранящейся тарелки/чашки с матричным покрытием при температуре 4 °C поместите ее в шкаф биологической безопасности и дайте ей нагреться до комнатной температуры не менее 30 минут.
- Аспират базальной мембраны матрикс полностью перед добавлением среды и клеток.
2. Приготовление среды E8
- Приготовьте питательную среду Е8, разморозив добавку Е8 в течение ночи при 4 °С.
- Удалите 10 мл базальной среды Е8 из бульона объемом 500 мл и выбросьте.
- Пипеткой весь флакон объемом 10 мл добавки Е8 непосредственно в 490 мл базальной среды Е8. Не нагревайте полную среду E8 на водяной бане при температуре 37 °C, так как повторяющиеся колебания температуры могут привести к ухудшению bFGF в полной среде E8.
- Используйте полную среду E8 в течение 2 недель после добавления добавки.
3. Размораживание iPSC
- Извлеките пузырек с замороженным ИПСК из жидкого азота и положите на сухой лед.
- Быстро разморозьте флакон на водяной бане при температуре 37 °C; вращайте флакон на водяной бане, пока не останется лишь крошечный фрагмент льда.
- Опрыскайте флакон 70% этанолом и переложите в шкаф биологической безопасности.
- Добавьте 1 мл среды комнатной температуры Е8 по каплям непосредственно во флакон.
- С помощью пипетки объемом 2 мл перенесите клеточную суспензию по каплям в 9 мл среды Е8 в конической пробирке объемом 15 мл. Часто вращайте пробирку, чтобы убедиться, что клетки и среда быстро перемешаются.
- Центрифугируйте клетки при 200 x g в течение 5 минут.
- Отсадите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в соответствующем объеме Е8 с добавлением 10 мкМ Y-27632.
- Добавьте ячейки в соответствующее количество лунок с матричным покрытием базальной мембраны и поместите в инкубатор с температурой 37 °C и 5% CO₂ на ночь. Рекомендуется наносить не менее 0,2 x 10⁶ iPSC на лунку 6-луночного планшета для обеспечения быстрого восстановления после размораживания.
4. Обслуживание и регулярное прохождение iPSC
- Обновляйте средний E8 ежедневно.
- Контролируйте морфологию и слияние клеток с помощью инвертированного микроскопа. ИПСК высокого качества растут плоскими колониями с четкими границами; отдельные колонии имеют «булыжный» вид.
- Проходите клетки iPSCs, когда они достигают ~70% конфлюенции.
- Приготовьте раствор для пассирования ЭДТА, добавив 0,9 г NaCl и 500 мкл 0,5 М ЭДТА к 500 мл DPBS. Хорошо перемешайте, чтобы растворить NaCl, и вакуумируйте для стерилизации. Перед пассированием нагрейте аликвоту раствора для пассации на водяной бане при температуре 37 °C.
- Для прохождения необходимо аспирировать отработанную питательную среду и промыть клетки однократно равным объемом теплого раствора для пропускания. Аспиратом и пипеткой достаточно раствора для пропускания ЭДТА, чтобы покрыть клетки (1 мл на лунку 6-луночного планшета).
- Поместите клетки под перевернутый микроскоп и понаблюдайте за колониями iPSC. Появление отверстий внутри колоний и приподнятых границ должно стать очевидным в течение 2-5 минут.
- Осторожно отсасывайте раствор для пассирования ЭДТА.
- С помощью пипетки объемом 10 мл нанесите 4 мл среды E8 (при использовании 6-луночного планшета) под высоким давлением непосредственно в каждую лунку, которую необходимо пропустить.
- Соберите скопления iPSC и разбейте их на соответствующее количество лунок в зависимости от коэффициента разделения от 1:8 до 1:12. Не переусердствуйте с пипеткой, так как дезагрегация клеточных скоплений приведет к снижению жизнеспособности.
- Поместите планшет в инкубатор и покачивайте планшет вперед-назад и из стороны в сторону несколько раз, чтобы рассеять клетки.
5. Подготовка MEF и iPSCs к трансфекции
- За 48 часов до трансфекции введите ИПСК в соотношении ~1:6 в четыре или более лунок 6-луночного планшета, покрытого матрицей базальной мембраны, так что через два дня они будут слиты на 70%.
- На следующий день разморозьте DR4 MEF в среду MEF, состоящую из DMEM (с высоким содержанием глюкозы) с добавлением 10% FBS и 1x MEM-NEAA.
- Поместите DR4 MEF в две 10-сантиметровые чашки при температуре ~ 2 x 10⁴ клеток/см² и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.
- В день трансфекции смените среду MEF на E8 с добавлением 10 мкМ Y-27632 за 30 мин до проведения трансфекции на iPSCs.
- Дополнительно: за 4 часа до трансфекции дополните культуру iPSC Y-27632 в конечной концентрации 10 μM.
6. Обработка реагентами с щадящей диссоциацией клеток и трансфекция ИПСК с использованием системы электропорации
- Удалите раствор для трансфекции первичных клеток P3 с 4 °C и дайте ему нагреться до комнатной температуры в течение ~30 мин. Добавьте всю добавку объемом 100 мкл в раствор для трансфекции перед использованием.
- Теплый реагент для диссоциации мягких клеток на водяной бане при температуре 37 °C.
- Получить доноры AAVS1 TALEN (pZT-AAVS1-L1 и pZT-AAVS1-R1) и донора AAVS1-CAG-EGFP при температуре -20 °C.
- Извлеките иПСК из инкубатора и один раз промойте DPBS.
- Добавьте 1 мл реагента для щадящей диссоциации клеток в лунку и инкубируйте иПСК при 37 °C в течение 5 мин или до тех пор, пока более 50% клеток не диссоциируют из питательного сосуда.
- Пипеткой вверх и вниз несколько раз с помощью пипетки p1000 для диссоциации любых оставшихся клеток из питательного сосуда и для разрушения скоплений iPSC.
- Добавьте 2 мл среды E8 в каждую лунку и несколько раз пипетка вверх и вниз с помощью пипетки объемом 10 мл для дальнейшего разделения клеточных групп на отдельные клетки.
заметка: Эффективность трансфекции значительно снижается, если клеточные скопления недостаточно дезагрегированы.
- Соберите иПСК в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 100 x g в течение 3 минут.
- Асасировать надосадочную жидкость и ресуспендировать клетки в минимальном количестве среды Е8.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра после нанесения жизненно важного красителя, например, 0,4% трипанового синего. Следите за тем, чтобы клетки были достаточно диссоциированы во время подсчета (1-3 клетки на «сгусток»).
- Распределите по 3 x 10⁶ ячейки в каждую из двух конических пробирок по 15 мл и снова поверните вниз при 100 x g в течение 3 мин.
заметка: Низкоскоростное центрифугирование снижает нагрузку на ячейку и позволяет легко повторно суспендировать иПСК перед электропорацией.
- Настройте систему электропорации на программу, специфичную для типа клеток для линии эмбриональных стволовых клеток человека H9 (программа CB-150).
- После центрифугирования аспирируйте надосадочную жидкость из клеточных гранул. К одной грануле добавьте 10 мкг донора HR в качестве контрольного образца. К другой грануле добавляют 10 мкг донора HR вместе с 5 мкг каждого TALEN (pZT-AAVS1-L1 и pZT-AAVS1-R1) в качестве экспериментального образца.
- Повторно суспендируйте каждую клеточную гранулу в 100 μл раствора для первичной трансфекции клеток P3 и перенесите в кювету.
- Проведите трансфекцию и сразу же добавьте в каждую кювету 500 мкл среды Е8 комнатной температуры.
- Переложите трансфицированные ИПСК по каплям в одну 10-сантиметровую чашку, содержащую DR4 MEF, приготовленную на шаге 5.4.
