phiC31-интегразо-опосредованная сайт-направленная трансгенная интеграция: техника микроинъекций для сайт-специфической трансгенной интеграции в вектор Anopheles

1. Подготовка плазмид для микроинъекционной смеси

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол, проиллюстрированный здесь, включает использование двух плазмид: донорской плазмиды, меченной attB (сайт прикрепления, полученный от бактерии-хозяина), несущей интересующий трансген, и вспомогательной плазмиды, экспрессирующей интегразу φC31 в соответствии с регуляцией промотора Hsp70 дрозофилы.

1. Очистите донорские и хелперные плазмиды с помощью набора для очистки плазмид, не содержащего эндотоксинов.
   заметка: Секвенируйте окончательный плазмидный препарат, используемый для инъекций, чтобы убедиться в целостности всех компонентов.
2. Соедините соответствующие количества двух плазмид для получения смеси с конечной концентрацией 350 нг/л донорской плазмиды и 150 нг/л вспомогательной плазмиды при ресуспендировании в инъекционном буфере.
   заметка: При расчете необходимого объема смеси следует учитывать, что 10-15 мкл достаточно для каждого дня запланированных инъекций, а ДНК можно заранее подготовить и хранить при -20 °С. Также сообщалось о концентрациях хелперных плазмид интегразы в 60-500 нг/мкл и концентрациях донорских плазмид в 85-200 нг/мкл.
3. Осаждение ДНК путем добавления 0,1 объема 3 М ацетата натрия (pH 5,2) и 2,5 объема ледяного 100% EtOH и вихря. Сразу должен быть виден белый осадок. Наличие высококонцентрированных исходных плазмидных препаратов (т.е. ~1 мкг/мкл) повышает эффективность осаждения.
   заметка: Точка остановки - осадок может храниться при температуре -20 °C в течение ночи.
4. Центрифугируйте при 15 000 x g в течение 20 минут при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу 1 мл ледяного 70% EtOH.
5. Промойте гранулу 1 мл ледяного 70% этиона и центрифугируйте при 15 000 x g в течение 5 минут при комнатной температуре.
6. Выбросьте надосадочную жидкость, не нарушая гранулы, и высушите на воздухе.
7. Ресуспендируйте гранулу в 1x инъекционном буфере (0,1 мМ Na₃PO₄, 5 мМ KCl, pH 7,2, 0,22 мкм стерилизованный фильтром) до достижения общей конечной концентрации 500 нг/л<бр/> заметка: Предположим, что в процессе осаждения будет потеряна часть ДНК; Поэтому сначала добавьте меньший объем инжекционного буфера, проверьте концентрацию на спектрофотометре (например, Nanodrop), а затем добавьте соответствующий оставшийся объем, чтобы достичь 500 нг/мкл.
8. Убедитесь, что ДНК полностью ресуспендирована, приготовьте аликвоты по 10-15 мкл каждая и храните их при температуре -20 °C.
9. В день инъекции разморозьте одну аликвоту и центрифугируйте при 15 000 x g в течение 5 минут, чтобы удалить остатки твердых частиц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативным методом удаления твердых частиц является фильтрация раствора через фильтр 0,22 мкм. Избегайте присутствия остатков твердых частиц в смеси для инъекций, так как они приводят к закупорке иглы во время микроинъекции эмбриона.

2. Микроинъекция эмбрионов из стыковочной линии Anopheles

1. Кровью кормить 4-7-дневных комаров с нужной стыковочной линии за 72 ч до микроинъекции (т.е. для инъекции в понедельник и вторник кормить самок в предыдущую пятницу; для инъекции в четверг и пятницу кормить самок в понедельник той же недели).
2. Кровью питаются комары дикого типа (WT) (т.е. комары с одинаковым геномным фоном стыковочной линии) в тот же день; они понадобятся для ауткроссинга.
   заметка: Размер и качество кровяной муки влияют на качество яиц, поэтому рекомендуется всегда использовать свежую кровь (т.е. кровь, взятую в течение предыдущих 7 дней). Кормление руками или кормление мышами может повысить качество и количество яиц, однако эти методы не рекомендуются. Для использования людьми и животными потребуются специальные утвержденные протоколы.
3. Выполнение микроинъекций эмбриона
   1. Выполните микроинъекции эмбриона An. gambiae в 25 мМ NaCl, нацеливаясь на задний полюс эмбриона под углом 45 градусов. Для получения подробной информации о сборе эмбрионов, выравнивании и микроинъекции обратитесь к Pondeville et al.и Lobo et al.
   2. Выполните микроинъекции эмбриона An. stephensi в галогеноуглеродное масло 700:27 (2:1), нацеливаясь на задний полюс эмбриона под углом 30 градусов. Подробный протокол сбора, выравнивания и микроинъекции эмбрионов можно найти в работе Terenius et al.и Lobo et al.
   3. Сразу после инъекции перенесите яйца в чашку Петри, наполненную стерильной дистиллированной водой (pH 7,2) и верните их в инсектарные условия.
4. После вылупления ежедневно перекладывайте личинок G₀ в лоток с подсоленной дистиллированной водой (0,1% тонизирующей соли) и выращивайте к куколкам.
5. Рекордная скорость вылупления (т.е. количество вылупившихся личинок/количество введенных эмбрионов).
   заметка: Движение эмбриона способствует вылуплению, поэтому желательно осторожное вращение. Вылупление должно начаться через ~48 ч после инъекции. Поскольку инъекция может вызвать небольшую задержку в развитии, рекомендуется продолжать наблюдение за поздно вылупившимися личинками в течение 3-4 дней.