$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Определение протоспейсера и построение плазмиды
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается первый шаг выбора подходящих протоспейсеров для конструирования sgRNA и дальнейшего лигирования в pMaOri.dCas9 (Рисунок 1). Эта последовательность протоспейсера состоит из последовательности из 20 нуклеотидов против желаемой мишени.
- Получить нуклеотидную последовательность интересующего гена для сайленсинга в GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). Отправьте его на веб-сервер CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) с параметрами, определенными для Streptococcus pyogenes Cas9 и соседнего протоспейсера мотива NGG после выбора "Fasta Target". Определите параметры для "CRISPR/Cas9" и PAM (протоспейсерный смежный мотив) NGG.
- На основании полученных результатов выбрать протоспейсеры с наилучшей возможной оценкой (зеленая стрелка), которые расположены максимально близко к 5'-концу кодирующей области и, что наиболее важно, содержатся в матричной (минусовой) цепи, так как для полного сайленсинга гена sgRNA должна спариваться с кодирующей цепью гена.
заметка: Мотив NGG не включается в окончательную последовательность sgRNA.
- Используйте промотор lipL32 для экспрессии одиночной направляющей РНК, содержащей вариабельную 20-нуклеотидную последовательность на 5'-конце и консервативную последовательность скаффолда dCas9. Объедините 20-нт последовательность, называемую протоспейсером, с промотором lipL32 (на его 5'-конце) и скаффолдом sgRNA (3'-конец) (рис. 1B).
заметка: Для получения хорошо определенного промотора lipL32 используйте промоторную область, содержащую -334 к TSS (Transcription Start Site, на основе Zhukova et al.). В таблице 1 приведена окончательная кассета с sgRNA.
- Сгенерируйте кассету с sgRNA с помощью последовательной ПЦР или обратитесь к коммерческому поставщику.
- После получения кассеты лигируйте ее в плазмиду pMaOri.dCas9 в месте рестрикции XmaI с обоих концов (cccggg).
- Расщепите кассету sgRNA и плазмиду pMaOri.dCas9 с помощью фермента рестрикции XmaI и приступайте к лигированию (рис. 1B).
- Выполнение этапов клонирования в ауксотрофном штамме E. coli π1 в связи с происхождением репликации pMaOri (и, соответственно, pMaOri.dCas9), R6K-gamma.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробный протокол лигирования и отбора клонов см. в предыдущих публикациях Фернандеса и Насименто. dCas9, управляемый sgRNA, будет связываться с кодирующей цепью выбранного гена, представляющего интерес, и, следовательно, будет препятствовать удлинению РНК-полимеразы (рис. 1C), что приведет к сайленсингу генов.
2. Преобразование лептоспир конъюгацией
ПРИМЕЧАНИЕ: Графическая схема этого шага представлена на рисунке 2. Для изготовления сред HAN и планшетов HAN обратитесь к Hornsby et al. и Fernandes et al.
- Выращивайте патогенные клетки лептоспир при 29 или 37 °C в среде HAN при перемешивании, разбавляя насыщенную культуру в свежей HAN в соотношении 1:100; как правило, L. interrogans serovar Copenhageni штамма Fiocruz L1-130 требуется 4-6 дней для достижения соответствующей плотности клеток.
- Перед использованием для конъюгации убедитесь, что культуры достигают внешнего диаметра 0,2-0,4 при 420 нм (от 2 до 5 x 108 клеток/мл).
заметка: Поскольку среда HAN меняет цвет по мере увеличения плотности клеток (из-за фенольного красного, содержащегося в среде DMEM), центрифугируйте (4000 x g, 15 мин, комнатная температура) 1 мл питательной среды для удаления лептоспир и применяйте надосадочную жидкость в качестве заготовки для измерения O.D.
- Трансформируйте конъюгативный штамм E. coli β2163, ауксотрофный для диаминопимелевой кислоты (DAP), с плазмидой pMaOri.dCas9, содержащей кассету sgRNA. Для трансформации E. coli используйте либо протоколы теплового шока, либо электропорацию. Включите трансформацию с помощью плазмиды pMaOri.dCas9 без кассеты sgRNA в качестве контроля.
- Для трансформации с помощью теплового шока смешайте плазмидную ДНК (100 нг) с химически компетентными клетками E. coli и инкубируйте на льду в течение 30 мин. Проведите тепловой шок при 42 °C в течение 90 с и снова поместите его на лед на 5 мин. Восстановите клетки, добавив 1 мл LB-среды, инкубируйте при 37 °C в течение 1 ч и приступайте к осаждению.
- Для электропорации используют электрокомпетентные клетки, смешанные со 100 нг плазмидной ДНК. Используйте следующие параметры для импульса: 1,8 кВ, 100 Ω и 25 μF. Восстановите ячейки, как описано выше.
- Трансформированные донорские клетки E. coli помещают в среду LB-агар с добавлением диаминопимелевой кислоты (DAP) (0,3 мМ) и спектиномицина (40 мкг/мл) для отбора плазмид.
- Для конъюгации выбирают по одной колонии из каждой пластины за сутки до дня конъюгации (который определяется путем мониторинга O.D. культур лептоспир).
- Выберите одну колонию E. coli β2163 из пустого pMaOri.dCas9 и одну из пластин pMaOri.dCas9sgRNA. Дайте им вырасти в течение ночи в 10 мл LB плюс DAP и спектиномицин при 37 °C.
- На следующий день разведите насыщенные культуры 1:100 в 10 мл свежего LB плюс DAP (не включайте антибиотик здесь) до OD420 нм 0,2-0,4. В норме E. coli требуется 2-3 часа, чтобы достичь такой плотности.
- Внутри биозащитного колпака BSL2 соберите фильтрационный аппарат, поместив мембранный фильтр диаметром 25 мм и размером пор 0,1 мкм на верхнюю часть стеклянного основания. Поместите сверху стеклянную воронку объемом 15 мл и удерживайте обе части пружинными зажимами. Подключите стекло к вакуумному насосу и добавьте культуры в воронку для фильтрации.
- Добавьте в воронку 5 мл культуры лептоспиры. Добавьте объем E. coli, чтобы получить пропорцию 1:1, основанную на значениях наружного диаметра420 нм для обеих культур. Включите вакуумный насос и сконцентрируйте ячейки методом фильтрации. После концентрации клеток в мембранном фильтре осторожно извлеките их. Убедитесь, что среда фильтруется через мембрану.
заметка: Фильтрация занимает от 5 до 10 минут.
- Поместите фильтр на имеющуюся в продаже пластину EMJH (см. Таблицу материалов) с добавлением DAP (0,3 мМ). Убедитесь, что бактерии находятся вверх. Инкубируйте планшеты при 29 °C в течение 24 ч.<бр/>
заметка: При использовании HAN или дополненных пластин EMJH производства E. coli может размножаться и преодолевать предполагаемое соотношение 1:1, что, в свою очередь, может снизить эффективность конъюгации.
- Через 24 часа извлеките фильтры из планшетов и поместите каждый отдельный фильтр в коническую пробирку объемом 50 мл.
- Используйте 1 мл жидкой среды HAN для высвобождения ячеек с поверхности фильтра путем интенсивного пипетирования и вортексинга.
- Визуализируйте восстановленные смешанные бактериальные растворы с помощью микроскопии в темном поле, чтобы проверить жизнеспособность и подвижность клеток, а также пропорции Leptospira:E. coli.
заметка: На этой стадии можно увидеть эквивалентное количество кишечной палочки и лептоспиры.
- Распределите 100-200 мкл этой культуры на планшеты HAN, содержащие 0,4% инактивированной сыворотки кролика и 40 мкг/мл спектиномицина. Инкубируйте планшеты при 37 °C в атмосфере с содержаниемCO2 3%.
strong>ПРИМЕЧАНИЕ: В норме клетки L. interrogans serovar Copenhageni штамма Fiocruz L1-130 образуют колонии за 5-7 дней на контрольных планшетах и за 8-10 дней на планшетах с спектиномицином. На этом этапе E. coli расти не будет, так как они являются ауксотрофными по отношению к DAP.
- В качестве контроля разведите культуры в дозе10-4 лептоспир/мл и добавьте 100 мкл на планшеты без антибиотика, для контроля лептоспирального роста.