Сайленсинг генов in vitro на основе обратной трансфекции миРНК: процедура доставки малых интерферирующих РНК в культивируемые клетки для инактивации экспрессии генов-мишеней

Аннотация

Источник: Jager, J. et al.Модель культуры клеток адипоцитов для изучения влияния модуляции белка и микро-РНК на функцию адипоцитов. J. Vis. Exp. (2021).

В этом видео мы описываем процедуру выполнения обратной трансфекции миРНК в адипоциты для модуляции экспрессии целевого белка.

Протокол

1. Подготовка пластин с предварительно нанесенным покрытием

1. За день до трансфекции или за несколько часов до трансфекции приготовьте раствор коллагена I типа в концентрации 100 мкг/мл в 30% этаноле из исходного раствора в концентрации 1 мг/мл. Добавьте 250 μL коллагена на лунку 12-луночного планшета и 125 μL на лунку 24-луночного планшета и распределите раствор по поверхности лунки.
2. Оставьте пластину без крышки под колпаком для культуры до тех пор, пока коллаген не высохнет. Дважды умыться фосфатно-солевым буфером Дульбекко (D-PBS).<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины с предварительно нанесенным покрытием доступны для покупки.

2. Приготовление трансфекционной смеси

ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация миРНК составляет от 1 до 100 нМ (от 1 до 100 пмоль миРНК на лунку 12-луночного планшета). Конечная концентрация мимика miR составляет 10 нМ (10 пмоль/лунка). Определите наилучшую концентрацию каждой миРНК, мимика miR или другого олигонуклеотида до начала эксперимента, чтобы избежать побочных эффектов. Проводите эксперименты по трансфекции в трех экземплярах для облегчения статистического анализа результатов. Подготовьте все реагенты в избытке, чтобы учесть нормальные потери во время пипетирования.

1. Смешайте с помощью пипетирования (объем/объем) миРНК (или другие олигонуклеотиды) с улучшенной минимальной незаменимой средой (Таблица 1). Выдерживать 5 минут при комнатной температуре.
2. Добавьте реагент для трансфекции и улучшенную минимальную незаменимую среду к миРНК и перемешайте с пипеткой (Таблица 1). Выдерживать 20 мин при комнатной температуре (за это время приступать к секции 3). Добавьте смесь для трансфекции в каждую лунку пластины, покрытой коллагеном.

3. Получение адипоцитов 3T3-L1

1. Промойте ячейки в чашке Петри 100 мм дважды с помощью D-PBS. Добавьте в ячейки 5-кратный трипсин (1 мл на 100 мм чашку), стараясь покрыть трипсином всю поверхность. Подождите 30 с и осторожно удалите трипсин.
2. Инкубировать чашку Петри в течение 5-10 минут при температуре 37 °C в инкубаторе. Постучите по тарелке 100 мм, чтобы отсоединить ячейки.
3. Добавьте 10 мл DMEM без пирувата, 25 мМ глюкозы, 10% FCS и 1% пенициллина и стрептомицин для нейтрализации трипсина. Осторожно пипетируйте среду вверх и вниз, чтобы отделить клетки и гомогенизировать клеточную суспензию.
4. Подсчитайте клетки с помощью счетной камеры Malassez или автоматического счетчика клеток и отрегулируйте концентрацию клеток до 6,25 x 10⁵ клеток/мл среды. Затравка 800 мкл клеточной суспензии/лунки 12-луночного планшета (5 x 10⁵ клеток) или 400 мкл клеточной суспензии/лунки 24-луночного планшета (2,5 x 10⁵ клеток), содержащей трансфекционную смесь><. заметка: Одна 100 мм чашка Петри с адипоцитами позволит приготовить один 12-луночный планшет или один 24-луночный планшет. Чашка диаметром 100 мм обычно содержит 6-7 x 10⁶ адипоцитов, что соответствует 5 x 10⁵ адипоцитов на лунку 12-луночного планшета.
5. Инкубируйте планшеты в инкубаторе для клеточных культур (7% CO2 и 37 °C) и не тревожьте клетки в течение 24 часов. На следующий день осторожно замените надосадочную жидкость свежей DMEM без пирувата, 25 мМ глюкозы, 10% FCS и по 1% пенициллина и стрептомицина.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Также возможно засеивание клеток в 48- и 96-луночные планшеты с коллагеновым покрытием, но при замене среды необходимо соблюдать дополнительные меры предосторожности, чтобы избежать отслоения адипоцитов.

	На лунку (12-луночный планшет)	На лунку (24-луночный планшет)
Олигонуклеотиды	20 μL	10 μL
(ми-РНК, miR...)
Улучшенный минималистичный носитель	20 μл	10 μл
Реагент для трансфекции	5,6 мкл	2,8 мкл
Улучшенный минималистичный носитель	154,4 мкл	77,2 мкл
Общий объем трансфекционной смеси	200 μл	100 мкл

Таблица 1: Реагенты для трансфекции, необходимые для 12-луночных и 24-луночных планшетов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
12-луночный планшет для культивирования тканей	Датчер	353043
2,5% трипсин (10x)	Gibco	15090-046	Разбавлено до 5x с D-PBS
2-Пропанол	сигма	И9516
3-изобутил-1-метилксантин	Сигма-Олдрич	Д5879
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	сигма	А7030
Коллаген I типа из кожи икр	Сигма-Олдрич	С 8919
Дексаметазон	Сигма-Олдрич	Д1756
Д-ПБС	Gibco	14190144
Модифицированная среда Dulbecco's Eagles (DMEM)	Gibco	41965062	4,5 г/л D-глюкозы; L-глютамин; без пирувата
этанол	сигма	51976
Мимика микро-РНК miRIDIAN	Горизонт Дискавери
FAM-меченая миРНК Negative Control	Инвитроген	АМ4620
Сыворотка для новорожденных телят	Gibco	16010-159
Фетальная бычья сыворотка	Gibco	10270-106
Пенициллин и стрептомицин	Gibco	15140-122
FAM-меченая миРНК Negative Control	Инвитроген	АМ4620
ON-TARGETplus Мышь Plin1 миРНК SMARTpool	Горизонт Дискавери	Л-056623-01-0005
Свободный глицериновый реагент	Сигма-Олдрич	Ф6428
Чашка Петри 100 мм х 20 мм	Датчер	353003
Реагент для трансфекции (ИНТЕРФЕРИН)	Полиплюс	409-10
Улучшенный носитель минимального содержания (Opti-MEM)	Gibco	31985-047 (Английский)
Инсулин человеческий рекомбинантный	Gibco	12585-014

г. гг.