$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Трансфекция ответной плазмиды, экспрессирующей интересующий ген (ГОИ), в первичные альвеолярные эпителиальные клетки
- Выделите альвеолярные эпителиальные клетки II типа из легких крыс.
- Засейте клетки при плотности 1 х 106 клеток/см2 в 100 мм чашки Петри полной минимальной необходимой средой (полным МЭМ). Полный МЕМ представляет собой МЕМ с добавлением 10% FBS, 0,08 мг/л тобрамицина, септры (3 мкг/мл триметоприма и 17 мкг/мл сульфаметоксазола), 0,2% NaHCO3, 0,01 М HEPES (pH = 7,3) и 2 мМ L-глутамина. Культивировать клетки в течение 24 ч при 37 °C в 5%CO2 в увлажненном инкубаторе.
- На следующий день поместите 500 μL полного MEM без антибиотика в каждую лунку нового 12-луночного планшета и предварительно прогрейте планшет при 37 °C в течение 30 минут. На этом этапе важно использовать фетальную бычью сыворотку, не содержащую загрязняющих тетрациклинов или со слишком низким уровнем, чтобы препятствовать индуцируемости.
- Подготавливают пробирки объемом 1,5 мл, содержащие плазмиду с индуцируемым ГОИ (плазмидой ГОИ) и регуляторным вектором (например, pTet-Off), добавляя 1 г плазмиды ГОИ и 1 г регуляторного вектора на лунку в ЛТ. Для экспериментов по коэкспрессии с РНК-связывающими белками (RBP) в смесь ДНК добавляют 1 г конститутивного вектора (например, pcDNA3), экспрессирующего интересующий RPB (рис. 4).
- Отсадите среду и аккуратно промойте клетки PBS (без кальция и магния), предварительно подогретым до 37 °C.
- Добавьте 5 мл 0,05% трипсина, предварительно подогретого до 37 °C, и инкубируйте клетки до тех пор, пока клетки не отделятся (2-4 минуты). Нейтрализуйте трипсин, добавив 10 мл полной МЕМ без антибиотика.
- Соберите клеточную суспензию в пробирку объемом 50 мл, промойте чашку Петри 4 мл среды, чтобы собрать как можно больше оставшихся клеток, а затем центрифугируйте клеточную суспензию при 300 х г в течение 5 минут.
- Осторожно аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл PBS. Посчитайте и вычислите количество клеток с помощью гемоцитометра.
- Центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 5 мин. Осторожно отаскайте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в буфере для ресуспензии в концентрации 4 x 107 клеток/мл. Добавьте клетки из пробирки объемом 1,5 мл, приготовленной на шаге 2.4, в концентрации 400 000 клеток на лунку и осторожно перемешайте их с помощью пипетирования вверх и вниз.
- Поместите трубку в устройство для электропорации и заполните ее 3,5 мл электролитического буфера.
- Вставьте позолоченный наконечник электрода в пипетку, полностью нажав на поршень. Аккуратно перемешайте содержимое пробирки объемом 1,5 мл и осторожно отсасывайте клетки с помощью пипетки. Будьте осторожны, чтобы пузырьки воздуха не попали внутрь наконечника, так как это вызовет электрическую дугу во время электропорации и приведет к снижению эффективности трансфекции.
- Вставьте пипетку в электропорационную станцию до тех пор, пока не раздастся щелкающий звук.
- Выберите подходящий протокол электропорации для альвеолярных эпителиальных клеток, соответствующий импульсному напряжению 1450 В и 2 импульсам шириной 20 мс, и нажмите кнопку «Пуск» на сенсорном экране.
- Сразу после трансфекции извлеките пипетку и перенесите клетки в лунку, предварительно заполненную полным МЕМ без антибиотика, предварительно нагретым до 37 °C.
- Повторите шаги 1.11-1.14 для остальных образцов.
- Аккуратно встряхните пластину, чтобы ячейки равномерно распределились по поверхности лунки. Инкубируйте клетки при 37 °C и 5%CO2 в увлажненном инкубаторе. Через 2 дня замените среду на полную МЕМ с антибиотиками.
- Подтвердите успешность трансфекции путем наблюдения за экспрессией eGFP под флуоресцентным микроскопом или с помощью проточной цитометрии с использованием контрольного вектора (рис. 1).
заметка: Этот этап является необязательным и требует дополнительной стадии трансфекции с использованием другой плазмиды, экспрессирующей eGFP, такой как pcDNA3-EGFP.
2. Индукция ингибирования транскрипции ГОИ
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть предварительно обработаны желаемыми методами лечения перед индукцией доксициклина, чтобы оценить их влияние на стабильность мРНК (Рисунок 3).
- Приготовьте стоковый раствор доксициклина в концентрации 1 мг/мл в деионизированной воде. Храните исходный раствор при температуре -20 °C в защищенном от света месте. Доксициклин, производное тетрациклина, используется вместо тетрациклина, потому что он имеет более длительный период полувыведения (в 2 раза), чем тетрациклин. Кроме того, для полной инактивации оперона тета требуется более низкая концентрация доксициклина.
заметка: Доксициклин может влиять на экспрессию мРНК эндогенного ГОИ. Чтобы убедиться в этом, следует проверить влияние 24-часового лечения доксициклином на альвеолярные клетки, чтобы подтвердить отсутствие каких-либо изменений в экспрессии ГОИ (рис. 2).
- Приготовьте свежий раствор доксициклина в концентрации 1 мкг/мл в полной МЕМ через 72 ч после трансфекции и подогрейте его до 37 °C.
- Замените среду 1 мл полной МЕМ, содержащей 1 мкг/мл доксициклина, на лунку для ингибирования транскрипции ГОИ.
- Инкубируйте несколько лунок при 37 °C в 5%CO2 в течение разного времени от 15 мин до 6 ч для оценки периода полувыведения мРНК ГОИ.
- В конце обработки промойте клетки ледяным PBS и лизируйте их с помощью коммерчески доступного набора для экстракции фенол-хлороформной РНК, добавив 500 мкл буфера на лунку и встряхнув планшет для гомогенизации клеток.
- Изолируйте РНК в соответствии с протоколом производителя. Определение выхода и чистоты РНК с помощью спектрофотометрии при длинах волн 230, 260 и 280 нм. Образцы РНК с соотношением 260:230 и 260:280 1,8 и 2,0 соответственно считаются чистыми.
заметка: Протокол можно поставить на паузу здесь.
