Трансформация генов на основе бинарного бактериального искусственного хромосомного вектора у растений арабидопсиса: метод получения трансгенных растений с вкраплением одной копии

1. Арабидопсис (Arabidopsis) Преобразование

1. Подготовьте растения Arabidopsis к преображению.
   1. Выращивайте растения Arabidopsis в теплице или камере выращивания с контролируемым климатом до тех пор, пока они не зацветут (12 горшков по 9 растений в каждом).
   2. Обрежьте первые болты, чтобы образовалось больше второстепенных болтов. Растения готовы к погружению через 4–6 дней после обрезки, когда у растений много незрелых цветочных головок и мало удобренных силиков.
2. Цветочное окунание
   1. Обмакните соцветия на 5–10 секунд в суспензию агробактерий, несущую Т-ДНК, клонированную бинарной бактериальной искусственной хромосомой или BIBAC. Используйте легкое помешивание.
   2. Оберните надземные части растений пищевой пленкой, чтобы поддерживать высокую влажность, и накройте горшки с растениями ящиком, чтобы растения оставались в темноте. Инкубируйте растения в течение 2 дней в теплице/камере для выращивания.
   3. Снимите коробку и пищевую пленку и вырастите растения до созревания в теплице/камере для выращивания.
      заметка: Для повышения эффективности трансформации те же растения можно повторно окунать через 7 дней после первого погружения.
   4. Соберите семена. Объедините и проанализируйте семена (T1) растений, преобразованные с помощью одной и той же конструкции, как один набор.
3. Скрининг на трансгенные растения.
   1. Для скрининга трансгенных растений, трансформированных производным pBIBAC-RFP-GW, проанализируйте семена с помощью флуоресцентной микроскопии. Чтобы определить экспрессию DsRed в оболочках семян, визуализируйте семена при возбуждении 560 нм и эмиссии 600–650 нм. Отделите флуоресцентные семена от нефлуоресцентных аналогов с помощью щипцов.
   2. Для скрининга трансгенных растений, трансформированных производным pBIBAC-BAR-GW, высевают семена в лотки, заполненные почвой (~2500 семян/0,1 м² ). Чтобы обеспечить равномерное распределение семян по лоткам, суспендируйте семена в 0,1% агаре в среде (MS) 0,5x Murashige Skoog и распределите семена с помощью пипетки объемом 1 мл.
      заметка: Чтобы стимулировать синхронное прорастание семян, инкубируйте семена не менее 2 дней при температуре 4 °C. Это можно сделать до или после посева семян.
      1. Опрыскайте рассаду 0,5% раствором Глюфосината-аммония через 2 недели и через 3 недели после посева в лотки. Используйте 500 мл раствора глюфосината-аммония на 1 м²
      .
      2. Пересадите выжившую рассаду в индивидуальные горшочки. Типичное изображение лотка с рассадой до и после (второй) обработки глюфосинатом-аммонием показано на рисунке 1.
      3. Проанализируйте растения, устойчивые к глюфосинат-аммонию, методом ПЦР на наличие интересующего конструкта.
         1. Выделите геномную ДНК растения для проведения ПЦР.

Рисунок 1: Лоток, заполненный рассадой арабидопсиса до и после обработки глюфосинатом-аммонием. Проростки, не экспрессирующие ген bar, который присутствует в T-ДНК PBIBAC-BAR-GW, погибают после опрыскивания раствором глюфосината-аммония. На фотографиях показан один и тот же лоток с рассадой (А) перед опрыскиванием Глюфосинатом-аммонием, через 14 дней после посева, и (В) через 10 дней, после двукратного опрыскивания.