Морфолино-опосредованное редактирование генов: техника нокдауна генов с использованием блокирующих трансляцию морфолигонуклеотидов в одноклеточных яйцах пещерных рыб

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Дизайн олиго морфолино

ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности для A. mexicanus доступны через National Center of Biotechnology Information (NCBI) Gene и NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), а также через браузер генома Ensembl (https://www.ensembl.org). При разработке морфолино для использования как в поверхностных, так и в пещерных формах, крайне важно выявить любые генетические вариации между морфами на этой стадии, чтобы можно было избежать использования этих генетических областей в качестве мишеней для морфолинов. Любая полиморфная вариация в пределах целевого сайта морфолино может привести к неэффективному связыванию. Конструкция аналогична другим рыбным системам, таким как данио-рерио, и ранее было показано, что она эффективно работает у A. mexicanus.

1. Дизайн morpholinos заметка: Морфолины, блокирующие трансляцию, блокируют трансляцию путем связывания с эндогенным стартовым сайтом и препятствуют связыванию трансляционного механизма с последовательностью мРНК через стерическое препятствие.
   1. Определите кодирующую область целевого гена, начиная с начального сайта ATG.
   2. Запишите первые 25 пар оснований целевой последовательности, скопировав и вставив последовательность в текстовый редактор или лабораторную тетрадь.
   3. Используя либо онлайн-программное обеспечение (например, http://reverse-complement.com), либо ручной перевод, сгенерируйте обратное дополнение целевой последовательности. Сохраните полученное обратное дополнение в текстовом редакторе или лабораторном блокноте.
   4. Заказать морфолино с обратной последовательностью комплемента в компании, которая генерирует морфолигонуклеотиды. Смотрите Таблицу материалов для компаний.

2. Микроинъекции

1. Подготовка инструментов общего назначения для инъекций
   заметка: Процедуры, описанные в этом разделе, были подробно описаны в других разделах, а обзор с незначительными изменениями представлен здесь.
   1. Создайте инъекционные пластины, налив теплую 3% агарозу, растворенную в воде рыбной системы, в чашку Петри объемом 100 мл. Осторожно поместите форму для литья яиц в только что залитую агарозу, чтобы сделать лунки для рыбьей икры. Поместите боковую часть формы в агар под углом 45°, а затем медленно опустите ее в агарозу; Медленное опускание формы под углом предотвращает попадание воздуха под форму. Аккуратно снимите форму, как только агароза застынет. Пластины можно хранить в герметичном виде при температуре 4 °C до 1 недели.
2. Сбор яйцеклеток одноклеточной стадии
   1. В ночь, в которую ожидается размножение, осматривайте резервуары каждые 15–30 минут и следите за яйцами на дне резервуара. Яйца получаются полупрозрачными, размером примерно 1 мм в диаметре.
   2. Используйте мелкоячеистую сетку для сбора икры и переложите ее в стеклянную миску, наполненную свежей водой для рыбной системы. Рассмотрите яйцеклетки под микроскопом, чтобы подтвердить, что яйцеклетки находятся на одноклеточной стадии.
   3. С помощью стеклянных пипеток перенесите одноклеточные яйцеклетки в инъекционные пластины. На этом этапе необходимы стеклянные пипетки, так как яйца прилипнут к пластику.
   4. С помощью пипетки осторожно выпустите яйца в лунки агарозной инъекционной пластины из секции 2.1. Заполните ряды предварительно прогретой (при комнатной температуре) инъекционной тарелки максимальным количеством яиц (30–40 в ряд, и до пяти рядов). Полные ряды помогают предотвратить движение яиц во время инъекций. Держите икру увлажненной на инъекционной пластине с небольшим количеством воды рыбной системы до начала инъекций.
3. Настройка пико-впрыска и общие рекомендации по оптимизации впрыска
   1. Заполните иглы для инъекций с помощью гелеобразных наконечников для пипеток, которые помещаются внутри капилляра, или с помощью стандартных наконечников для микропипеток и добавив 2–4 мкл болюса до конца. После того, как игла будет заполнена, используйте щипцы, чтобы обрезать лишнюю длину инъекционной иглы.
   2. Выполняют микроинъекции с помощью иглы, вмонтированной в микроманипулятор, соединенной с микроинъектором пиколитра.
   3. Установите время впрыска на 0,03 с и давление на ~0,0 фунта на квадратный дюйм. Давление впрыска будет варьироваться соответственно с незначительными различиями между иглами, поэтому оптимизируйте для достижения болюсной инъекции ~1,0 нл.
      заметка: Давление впрыска часто находится в диапазоне ~10–30 фунтов на квадратный дюйм.
   4. Стандартизируйте инъекционный болюс путем впрыска в минеральное масло и измерения размера болюса с помощью предметного микрометра для достижения объема впрыска ~1–1,5 нл. Отрегулируйте давление впрыска (psi) для увеличения или уменьшения объема болюса.
   5. Слейте воду с самой верхушки яиц с помощью лабораторной салфетки.
      заметка: Хорион из яиц Astyanax немного сложнее для проникновения, чем из яиц рыбок данио. Мы обнаружили, что отвод воды от верхней части яиц помогает облегчить проникновение иглы внутрь яйца. Оптимизация тарелки позволяет разместить ~200 яиц на одной тарелке.
   6. С помощью микроманипулятора проникните иглой в каждое яйцо и введите его непосредственно в желток. После установки в желток введите яйцо, нажав кнопку инъекции или ножную педаль инъекции.
      заметка: Полная пластина может быть введена в течение ~15 минут. Одноклеточный этап длится ~40 минут.
4. Инъекции морфолинос<бр /> заметка: Количество морфолино, необходимое для нокдауна, не вызывая токсичности, должно быть оптимизировано для каждой генной мишени; Тем не менее, концентрация в 400 пг является хорошей отправной точкой.
   1. Приготовьте морфолино так, чтобы на одно яйцо вводилось 400 пг морфолино. Разморозьте морфолино на льду. Раствор для инъекций состоит из морфолино (в желаемой концентрации), H2O без РНКазы или раствора Данио и фенолового красного (10% от конечного объема). Пример приведен в таблице 1.
   2. Введите 1 нл на эмбрион
   .