Tol2 транспозон-опосредованный трансгенез данио-рерио: процедура получения трансгенных данио-рерио после совместной инъекции системы Tol2 в оплодотворенные эмбрионы данио-рерио

Аннотация

Источник: Silic, M. R., et al. Визуализация клеточной электрической активности у ранних эмбрионов и опухолей рыбок данио. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео мы демонстрируем процедуру создания стабильной трансгенной линии данио-рерио, конститутивно экспрессирующей белок индикатора флуоресцентного напряжения, после совместной инъекции системы транспозона Tol2, содержащей мРНК транспозазы и конструкцию транспозона Tol2, кодирующую флуоресцентный индикатор напряжения.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Микровпрыск

1. Установите 4-6 аквариумов для разведения, по крайней мере, с 2 самцами и 2 самками во второй половине дня перед инъекцией. Этих рыб нельзя кормить во второй половине дня. Этот шаг уменьшит количество отходов жизнедеятельности рыб и сэкономит время на их уборку на следующее утро, а также поможет вызвать реакцию размножения.
2. На следующее утро извлеките приготовленный раствор для инъекций, состоящий из: (i) конструкции транспозона Tol2, содержащей промотор убиквитина рыбки данио-рерио и ген индикатора флуоресцентного напряжения Accelerated Sensor of Action Potentials 1 (ASAP1), и (ii) мРНК Tol2, из морозильной камеры при температуре -80 °C и положите его на лед.
3. Потяните за разделители в резервуарах для разведения рыб и дайте рыбам возможность спариваться. В целом, рыбы откладывают икру уже через 20-30 минут после выдергивания разделителя. Если нет, подождите еще 1-2 часа. Некоторые рыбы могут вообще не откладывать икру. В этом случае повторите этот эксперимент для сбора эмбрионов рыб
.
4. Во время ожидания убедитесь, что у вас подготовлены иглы со сломанным кончиком под углом, создающим скошенный край с помощью щипцов, или путем обламывания тонкой рабочей салфетки.
   1. Вытяните иглы из капиллярного стекла на съемник микропипетки, используя следующие параметры: нагрев 545; вытягивание 60; скорость 80; время 250; давление 500. Сломайте иглу щипцами под эндоскопом для рассечения (с линейкой окуляра для оценки диаметра), держа щипцы под углом примерно 45°. Желаемый диаметр иглы может варьироваться в зависимости от настроек микроинъектора, но меньший диаметр предпочтительнее для снижения смертности эмбрионов.
5. После того, как рыбы отложили икру, соберите ее в чашку Петри диаметром 10 см и поднесите к области вскрытия. Удалите все аномальные эмбрионы и отходы жизнедеятельности рыб.
6. Пипетируйте оплодотворенные эмбрионы в подготовленную форму для литья под давлением с 3% агарозой. Удалите лишнюю воду, чтобы сохранить эмбрионы на месте.
7. Как только все ряды будут заполнены жизнеспособными эмбрионами, расположите их так, чтобы все отдельные клетки были обращены в одном направлении к игле, которая находится под углом около 45° по горизонтали. Это значительно облегчит укол в дальнейшем.
8. Надев перчатки, используйте загрузочный наконечник пипетки объемом 20 мкл и удалите 5 мкл подготовленной конструкции из пробирки на лед.
9. Осторожно вставьте наконечник в задний конец разорванной капиллярной трубки до того места, где он начинает сужаться, чтобы реагент оказался как можно ближе к наконечнику. Если пузырьки воздуха все еще остались, встряхните иглу, следя за тем, чтобы не сломать кончик.
10. Вставьте иглу прямо в иглодержатель для микроинъекций и осторожно затяните, пока игла не останется на месте. Отрегулируйте угол примерно до 45°.
11. После того, как игла подготовлена и прикреплена, включите микроскоп и баллон с газовым давлением. Коммерческие резервуары CO₂ в целом хороши для этой цели. Объем впрыска регулируется давлением выдержки и выброса: приблизительно 0,5 фунта на квадратный дюйм для выдержки и 30 фунтов на квадратный дюйм для выброса. Обязательно проверяйте, что раствор выходит при нажатии на педаль.
12. С помощью ступенчатого микрометра с каплей минерального масла отрегулируйте объем и расход раствора до ~150 мкм в диаметре (около 2 нл). Следите за тем, чтобы при обратном давлении небольшое количество капало из иглы. Если противодавления недостаточно, капиллярное действие приведет к попаданию жидкости в иглу и разрушению мРНК.
13. После того, как игла откалибрована, начните вводить конструкцию в одну клетку оплодотворенных эмбрионов.
    заметка: Это требует большой практики, терпения и утонченности, поскольку клеточную мембрану трудно проколоть. Важно вводить в клетку раствор, а не желток, для получения трансгенных рыбок данио. Это отличается от инъекции морфолино. Не имеет значения, с какой стороны игла входит в клетку, главное, чтобы конструкция шла в клетке. Трансгенез будет иметь очень низкий уровень успеха, если ввести его в желток, а не в клетку. Также важна инъекция в одну клетку, иначе будет создана соматическая рыба-химера. Это снизит вероятность попадания трансгена в половые клетки.
14. Используйте край гелевой выемки, чтобы обеспечить подложку, которая удерживает эмбрион на месте и позволяет игле оказывать давление, не перемещая эмбрион. Как только кончик иглы окажется в одной ячейке, нажмите на педаль, чтобы выпустить нужное количество раствора. Повторите этот процесс для всех эмбрионов.
15. По завершении перенесите введенные эмбрионы в промаркированную чашку, промыв их из агарозной выемки водой рыбной системы и одноразовой пипеткой для переноса объемом 3,4 мл. Храните эмбрионы в инкубаторе при температуре 28,5 °C, чтобы они могли развиваться.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Агароза РА	Амреско	Н605-500Г	Для изготовления гелей для инъекций
Эндоскоп для рассекания светлых полей	Компания Nikon	СМЗ 745	Дехорионация, микроинжекция, монтаж
Одноразовая переводная пипетка 3,4 мл	Термо Сайентиал	13-711-9УТРА	Эмбрионы рыб и перенос воды
Щипцы #5	ВПИ	500342	Дехорионация и поломка иглы
Наконечник для погрузки	Эппендорф	930001007	Для загрузки раствора для инъекций в капиллярные иглы
Пресс-форма для микролитья под давлением	Инструменты адаптивной науки	ТУ-1	Подготовить формовочный лоток для хранения эмбрионов рыб во время впрыска
Микроинъектор	ВПИ	Пневматический пиконасос PV820	Инжектор микровпрыска
Микроманипулятор	ВПИ	Микроинжектор MM3301R	Операция микровпрыска
Съемник микропипеток	Инструмент Саттера	-1000	Для приготовления капиллярной иглы
нефтепродукт	Амреско	J217-500мл	Для калибровки объема впрыска
Пластиковые чашки Петри	ВВР	25384-088 (Английский)	Для удержания рыбы или рыбьих эмбрионов в процессе визуализации
Микрометр ступенчатого	Am Scope	МР100	Калибровка объема микровпрыска
Тонкостенные стеклянные капилляры	ВПИ	ТВ100Ф-4	Необработанное стекло для изготовления капсульной иглы

стекла