Транспозон-опосредованное редактирование генов PiggyBac в ИПСК человека: процедура интеграции интересующего гена в ИПСК человека с использованием транспозонной системы PiggyBac

Аннотация

Источник: Garone, M. G. et al. Преобразование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (iPSCs) в функциональные спинальные и черепные моторные нейроны с использованием векторов PiggyBac. J. Vis. Exp. (2019)

Это видео демонстрирует процедуру генерации моторных нейронов путем трансфекции человеческих iPSC с помощью транспозонной системы PiggyBac путем эктопической экспрессии факторов транскрипции, специфичных для линии.

Протокол

1. Генерация индуцируемых iPSC линий NIL и NIP

1. Клеточная трансфекция
   1. Промойте клетки PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ free).
   2. Добавьте реагент для диссоциации клеток (см. Таблицу материалов) (0,35 мл для чашки диаметром 35 мм) и инкубируйте при 37 °C до тех пор, пока отдельные клетки не станут
   3. отделенный (5-10 мин).
   4. Аккуратно завершите разделение клеток, пипетируя пипеткой вверх и вниз пипеткой P1000 3-4 раза.
   5. Соберите в пробирку объемом 15 мл и добавьте PBS (Ca^2+/Mg²⁺ free) в 10 мл. Посчитайте клетки.
   6. Пеллеты 10⁶ элементов и ресуспендировать в 100 мкл буфера R (входит в комплект электропорации ячеек, см. Таблицу материалов).
   7. Добавить плазмидную ДНК для трансфекции: 4,5 мкг транспонируемого вектора (epB-Bsd-TT-NIL или epB-Bsd-TT-NIP) и 0,5 мкг плазмиды транспозазы piggyBac.
   8. Трансфект с помощью системы электропорации ячеек (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкцией производителя со следующими параметрами: напряжение 1 200 В, ширина 30 мс, 1 импульс. Семена клеток в среду iPSC человека с добавлением 10 μM Y-27632 (ингибитор ROCK, см. Таблицу материалов) в чашке с матричным покрытием толщиной 6 мм.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
В27	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-093-566	Бессывороточная добавка для поддержания нейрональных клеток
Бамбанкер	Ниппон Дженетикс	НГЭ-ВВ02	Среда для замораживания клеток для предшественников моторных нейронов
CaCl2	Сигма-Олдрич	С3881	Химические реагенты для электрофизиологических растворов
Матрица, сертифицированная Corning Matrigel hESC	Корнинг	354277	Восстановленный препарат базальной мембраны из саркомы мышей Энгельбрета-Холма-Роя (EHS). Используется для адгезии иПСК к пластиковым и стеклянным опорам
ФИЛЬТРУЮЩИЙ МАТЕРИАЛ CRYOSTEM ACF	Биологическая промышленность	05-710-1Е	Замораживающая среда для ИПСК человека
Диспайз	Gibco	17105-041	Реагент для щадящей диссоциации иПСК человека
DMEM/F12	Сигма-Олдрич	Д6421-500МЛ	Базальная среда для культивирования клеток
Доксициклин	Сигма-Олдрич	Д9891-1Г	Используется для индукции экспрессии трансгенов из векторов epB-Bsd-TT-NIL и epB-Bsd-TT-NIP
ДС2У	WiCell	UWWC1-DS2U	Коммерческая линия iPSC для человека
ГДНФ	ПрепроТех	450-10	Глиальный нейротрофический фактор
Gibco Episomal hiPSC Line	Thermo Fisher Scientific	А18945	Коммерческая линия iPSC для человека
Хепес	Сигма-Олдрич	Н4034	Химические реагенты для электрофизиологических растворов
Ламинин	Сигма-Олдрич	11243217001	Способствует прикреплению и росту нервных клеток in vitro
NEAA	Thermo Fisher Scientific	11140035	заменимые аминокислоты. Используется в качестве добавки к клеточной культуральной среде, для увеличения роста и жизнеспособности клеток.
Набор Neon 100 μL	Thermo Fisher Scientific	MPK10096	Комплект для электропорации ячеек
Неоновая трансфекционная система	Thermo Fisher Scientific	MPK5000	Система электропорации ячеек
Нейробазальная среда	Thermo Fisher Scientific	21103049	Базальная среда, предназначенная для длительного поддержания и созревания популяций нейрональных клеток без необходимости использования питающего слоя астроцитов
NutriStem-XF/FF	Биологическая промышленность	05-100-1А	Питательная среда для ИПСК человека
PBS Ca2+/Mg2+ свободный	Сигма-Олдрич	Д8537-500МЛ	Фосфатный буферный раствор Дульбекко, без кальция, без магния
Пенициллин/стрептомицин	Сигма-Олдрич	П4333-100МЛ	Раствор пенициллина/стрептомицина, используемый для предотвращения контаминации клеточных культур бактериями.
Y-27632 (ингибитор ROCK)	Энцо Медико-Биологические Науки	АЛКС-270-333-М005	Проникающий в клетки селективный ингибитор Rho-ассоциированной, спиральной спирали, содержащей протеинкиназу (ROCK). Повышает выживаемость iPSC