$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Дизайн гРНК для вектора CRISPR-конкатемер
ПРИМЕЧАНИЕ: Цель этого раздела - объяснить, как выбрать наилучшую стратегию нацеливания и как спроектировать гРНК, содержащие определенные выступы для вектора CRISPR-конкатемера.
- Проектируйте гРНК против интересующих генов с помощью выбранного инструмента дизайна гРНК CRISPR. Пример см. в Таблице материалов.
заметка: При нацеливании на пару паралогичных генов, хотя возможно сконструировать одну гРНК на ген, рекомендуется сконструировать две гРНК на ген, чтобы увеличить шансы на достижение двойного нокаута (рис. 1).
- Убедитесь, что гРНК не содержат сайт распознавания BbsI, с помощью инструмента отображения рестрикции (см. пример в Таблице материалов).
- Добавьте к каждому олигопласту определенные векторные свесы CRISPR-concatemer, как показано в таблице 1.
2. Клонирование гРНК в вектор CRISPR-конкатемер
- Фосфорилирование и отжиг олиго
заметка: На этом этапе показано, как отжигать верхнюю и нижнюю нити для каждого олиго гРНК и как фосфорилировать их концы в одной реакции.
- Приготовьте реакционную смесь для фосфорилирования олигонов и отжига верхних и нижних нитей на льду, следуя приведен><ным ниже инструкциям.
заметка: Все олигопласты могут быть объединены в одну реакцию; Например, в случае вектора-конкатемера из 4 гРНК, объедините 8 олигону.
- Для 3 конкатемеров используйте верхнюю цепь 3,0 мкл гРНК (1,0 мкл от каждой гРНК; 10 мкМ, 1 мкл/гРНК), 3,0 мкл нижней цепи гРНК (1,0 мкл от каждой гРНК; 10 мкМ, 1 мкл/гРНК), 2,0 мкл буфера ДНК-лигазы T4 (10x), 1,0 мкл T4 PNK и добавьте H2O до общего объема 20,0 μл.
- Хорошо перемешайте с помощью пипетирования и запустите его в амплификаторе со следующими настройками: 37 °C в течение 30 минут, 95 °C в течение 5 минут, уменьшите температуру до 25 °C при 0,3 °C/мин, держите при 4 °C.
- BbsЯ перетасовываю реакцию
заметка: В этом разделе предварительно отожженные олигоины гРНК встраиваются в соответствующее положение конкатемерного вектора за один этап путем чередования циклов расщепления и лигирования.
- Разбавьте реакционную смесь в соотношении 1:100 в воде, не содержащей ДНКазы/РНКазы, для получения векторов конкатемера 3 и 4 гРНК.
заметка: При клонировании 2 гРНК-конкатемеров этот шаг не нужен.
- Соберите BbsI перетасовка реакции на льду, следуя приведенным ниже инструкциям. Включите отрицательный элемент управления, который содержит только вектор.
- Используйте 100 нг вектора CRISPR-конкатемера, 10,0 мкл смеси олиго, 1,0 мкл буфера фермента рестрикции, содержащего 1,0 мкл (10x), 1,0 мкл DTT (10 мМ), 1,0 мкл АТФ (10 мМ), 1,0 мкл BbsI, 1,0 мкл Т7 лигазы и H2O до общего объема 20,0 мкл.
- Хорошо перемешайте с помощью пипетирования и запустите его в термоамплификаторе со следующими настройками: Запустите 50 циклов для клонирования 3 и 4 конкатемеров гРНК и 25 циклов для 2 конкатемеров гРНК, оба при 37 °C в течение 5 минут, 21 °C в течение 5 минут, держите при 37 °C в течение 15 минут, затем 4 °C навсегда.
- Лечение экзонуклеазами
заметка: Этот шаг настоятельно рекомендуется, так как он повышает эффективность клонирования за счет удаления любых следов линеаризованной ДНК.
- Обрабатывайте реакцию перетасовки BbsI с помощью ДНК-экзонуклеазы (см. Таблицу материалов) следующим образом.
- Возьмите 11,0 мкл смеси для лигирования на предыдущем этапе (2.2.3), добавьте 1,5 мкл экзонуклеазного буфера (10x), 1,5 мкл АТФ (10 мМ), 1,0 мкл экзонуклеазы ДНК и доведите общий объем до 15,0 мкл с водой. Инкубировать при 37 °C в течение 30 мин, затем при 70 °C в течение 30 мин.
заметка: На этом этапе удаляется любая остаточная линеаризованная ДНК в смеси и, таким образом, повышается эффективность клонирования.
- Используйте 2 мкл реакционной смеси для превращения в химически компетентные бактерии E. coli путем теплового шока.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы реакцию можно хранить до одной недели при температуре -20 °C.
3. Трансфекция кишечных органоидов методом электропорации
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание, что эта процедура основана на протоколе, опубликованном Fujii et al. в 2015 году, с адаптацией для культур органоидов тонкого кишечника мышей.
- Предварительная электропорация
заметка: В этом разделе описывается, как получить кишечные органоиды мыши перед электропорацией путем удаления всех антибиотиков и кондиционированных сред из их питательной среды. Это предотвратит возможные токсические эффекты во время электропорации.
- На 0-й день процедуры трансфекции расщепляют органоиды в соотношении 1:2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Культуры кишечных органоидов могут быть получены путем проведения изоляции крипты в соответствии с ранее установленными протоколами. Пожалуйста, обратитесь к таблице 2 для всех композиций носителей.
- При расщеплении органоидов для электропорации засейте минимум 6 лунок 48-луночного планшета за одну трансфекцию.
- Засейте органоиды в капли матрицы объемом 20 мкл и вырастите их в среде WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + R-спондин + никотинамид) при 37 °C, 5%CO2 в увлажненном инкубаторе (как описано ранее).
- На 2-й день смените среду, заменив WENR+Nic на 250 мкл EN (EGF + Noggin) + CHIR99021 (ингибитор гликогенсинтазы киназы-3) + Y-27632 (ингибитор ROCK), без антибиотиков (см. таблицу 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: На всех этапах количество среды, добавляемой в каждую лунку 48-луночного планшета, составляет 250 мкл.
- На 3-й день смените органоидную среду на EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1,25% v/v диметилсульфоксида (ДМСО), без антибиотиков.
- Подготовка клеток
заметка: В этой статье мы опишем, как фрагментировать органоиды на мелкие клеточные кластеры путем механической и химической диссоциации. Эти шаги имеют решающее значение для успеха процедуры.
- На 4-й день разрушьте купола матрицы основания с помощью наконечника для пипетки объемом 1 мл и перенесите органоиды в пробирку объемом 1,5 мл. Бассейн содержимого четырех лунок 48-луночной пластины в трубку.
- Механически разбивайте органоиды на мелкие фрагменты, пипетируя пипеткой вверх и вниз с помощью пипетки P200 примерно 200 раз. Центрифуга при комнатной температуре, 5 мин при 600 x g.
- Удалите среду и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл рекомбинантной протеазы клеточной культуры (см. таблицу материалов). Инкубируйте при температуре 37 °C в течение максимум 5 минут, а затем проверьте каплю образца объемом 50 мкл под микроскопом с инвертированным светом с объективом 4x.
заметка: Желательны кластеры по 10-15 клеток, так как это повышает выживаемость клеток после электропорации.
- Перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл с низким связыванием и остановите диссоциацию, добавив 9 мл базальной среды без антибиотиков (см. таблицу 2). Центрифугируйте при комнатной температуре, 5 мин при 600 x g, затем выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл восстановленной сывороточной среды (см. Таблицу материалов).
- Подсчитайте количество ячеек с камерой Бюркера и используйте минимум 1 x 105 ячеек на одну реакцию электропорации. Добавьте 9 мл восстановленной сывороточной среды в пробирку объемом 15 мл и центрифугуйте при комнатной температуре, 3 мин при 400 х г.
- Электропорация<бр />
заметка: В следующих разделах приведены инструкции по проведению электропорации и последующему восстановлению органоидов.
- Удалите всю надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в растворе для электропорации (см. Таблицу материалов). Добавьте в суспензию клетки в общей сложности 10 г ДНК и добавьте раствор электропорации до конечного объема 100 μл и держите смесь клетки и ДНК на льду. Используйте векторы-конкатамеры CRISPR в сочетании с плазмидой экспрессии Cas9 (например, Addgene #41815) в соотношении 1:1.
заметка: Общий объем добавляемой ДНК должен быть меньше или равен 10% от общего объема реакции.
- Включите отдельную трансфекционную смесь, содержащую GFP-плазмиду для оценки эффективности трансфекции (например, pCMV-GFP, Addgene #11153 или любую генерическую GFP-экспрессирующую плазмиду).
- Добавьте смесь клетки-ДНК в кювету для электропорации и поместите ее в камеру электропоратора. Измерьте импеданс, нажав соответствующую кнопку на электропораторе, и убедитесь, что он составляет 0,030-0,055 кОм. Проводите электропорацию в соответствии с настройками, приведенными в таблице 3.
заметка: Если значение импеданса выходит за пределы допустимого диапазона, отрегулируйте объем раствора в кювете.
- Добавьте в кювету 400 мкл буфера для электропорации + Y-27632, а затем переложите все в пробирку объемом 1,5 мл. Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы дать клеткам восстановиться, а затем вращать их при комнатной температуре в течение 3 минут при 400 x g.
- Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 20 мкл/лунку матрицы фундамента. Засейте примерно от 1 x 104 до 1 x 105 клеток на лунку в 48-луночный планшет и добавьте EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1,25% v/v среды DMSO. Инкубировать при 37 °C.
- На 5-й день измените среду на EN + CHIR99021 + Y-27632 и проверьте эффективность трансфекции, наблюдая за экспрессией GFP (рис. 2). Храните органоиды при температуре 37 °C и обновите среду EN + CHIR99021 + Y-27632 через 2 дня.
- На 9 день смените среду на WENR + Nic + Y-27632 и инкубируйте при 37 °C.
заметка: Y-27632 можно удалить через 7-10 дней (на 16-19 день).
| Кассета 1 | Кассета 2 | Кассета 3 | Кассета 4 |
| Последовательность (5′-3′) | CACCGG[gRNA1]GT | ACCGG[gRNA2]G | КГГ[гРНК3] | ACACCGG[gRNA4]GTT |
| Последовательность (5′-3′) | TAAAAC[RC-gRNA1]CC | AAAAC[RC-gRNA2]C | AAAC[RC-gRNA3] | CTAAAAC[RC-gRNA4]CCG |
Таблица 1: Выступы для каждой кассеты вектора CRISPR-конкатемера.
| Базальная среда | | Комментарии |
| Хранить при температуре 4 °C в течение 4 недель | | |
| Среда для культивирования клеток | 500 мл | Посмотреть таблицу материалов |
| L-глютамин | 100x 5 мл | |
| Буферизатор 1 М | 5 мл | Посмотреть таблицу материалов |
| Пенициллин стрептомицин | 100x 5 мл | |
| WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + Rspondin + Nicotinamide) | | |
| Хранить при температуре 4 °C в течение 2 недель | | |
| Базальная среда | до 50 мл | |
| Добавка без сыворотки нейрональных клеток (50x) | 1 мл | Посмотреть таблицу материалов |
| Добавка без сыворотки нейрональных клеток (100x) | 500 мкл | Посмотреть таблицу материалов |
| н-ацетилцистеин (500 мМ) | 125 μл | |
| ЭФР мыши (100 мкг/мл) | 25 мкл | |
| мышиный Noggin (100 мкг/мл) | 50 μл | |
| Кондиционированная среда R-Spondin | 5 мл | |
| Wnt3a кондиционированная среда | 25 мл | |
| Никотинамид (1 М) | 250 мкл | |
| EN + CHIR + Y-27632 (ЭФР + Noggin + CHIR + Y-27632) | | |
| Хранить при температуре 4 °C в течение 2 недель | | |
| Базальная среда без пенициллина стрептомицина | до 20 мл | |
| Добавка без сыворотки нейрональных клеток (50x) | 400 мкл | Посмотреть таблицу материалов |
| Добавка без сыворотки нейрональных клеток (100x) | 200 μл | Посмотреть таблицу материалов |
| н-ацетилцистеин (500 мМ) | 50 μл | |
| ЭФР мыши (100 мкг/мл) | 10 μл | |
| мышиный Noggin (100 мкг/мл) | 20 μл | |
| Y-27632 (10 мкМ) | 20 μл | |
| CHIR99021 (8 мкМ) | 10 μл | |
| EN (EGF + Noggin) | | |
| Хранить при температуре 4 °C в течение 4 недель | | |
| Базальная среда | до 50 мл | |
| Добавка без сыворотки нейрональных клеток (50x) | 1 мл | Смотрите таблицу материалов |
| Добавка без сыворотки нейрональных клеток (100x) | 500 мкл | Смотрите таблицу материалов |
| н-ацетилцистеин (500 мМ) | 125 μл | |
| ЭФР мыши (100 мкг/мл) | 25 мкл | |
| мышиный Noggin (100 мкг/мл) | 50 μл | |
Таблица 2: Состав органоидной среды.
T
| Поринг пульса | Передаточный импульс |
| напряжение | 175 В | 20 В |
| Длина импульса | 5 мсек | 50 мсс |
| Интервал между импульсами | 50 мсс | 50 мсс |
| Количество импульсов | 2 | 5 |
| скорость разложения | 10% | 40% |
| полярность | + | +/- |
Таблица 3: Настройки электропорации.
