Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Установка программного обеспечения
- Следуйте инструкциям по установке программного обеспечения из https://github.com/bsbrl/Autoinjector.
2. Приготовление реактивов и пипеток
- Агароза: Приготовьте 3% агарозу путем раздельного растворения 3 г агарозы широкого диапазона и 3 г агарозы с низкой температурой плавления в 100 мл PBS для клеточных культур в двух отдельных стеклянных флаконах объемом 200 мл соответственно. Хранить при комнатной температуре до 3 месяцев.
- Раствор Тирода: Растворите 1 г гидрокарбоната натрия и соли Тироде (используйте содержимое всей бутылки) и 13 мл 1 М HEPES в 1 л дистиллированной воды. Отрегулируйте pH до 7,4. Отфильтруйте раствор через бутылочный фильтр 0,2 мкм.
- Срез питательной среды (SCM): Добавьте 10 мл сыворотки крысы, 1 мл 2 мл глутамина, 1 мл пенициллин-стрептомицина (100x), 1 мл добавки N-2 (100x), 2 мл добавки B27 (50x) и 1 мл буфера HEPES (pH 7,3) в 84 мл нейробазальной среды. Аликвота 5 мл SCM в 15 мл пробирок. Хранить при температуре -20 °C.
- CO2-независимая микроинъекционная среда (CIMM): Приготовьте 5x модифицированный раствор DMEM с низким содержанием глюкозы (без фенолового красного), растворив порошок в 200 мл дистиллированной воды. Отфильтруйте раствор через фильтр на крышке бутылки 0,2 мкм (для порошка DMEM используйте содержимое всей бутылки). Для приготовления 100 мл CIMM смешайте 20 мл 5x модифицированного раствора DMEM, 1 мл буфера HEPES, 1 мл добавки N2 (100x), 2 мл добавки B27 (50x), 1 мл пенициллин-стрептомицина (100x), 1 мл 2 мл глутамина и 74 мл дистиллированной воды. Хранить раствор при температуре 4 °C.
- Буфер для восстановления: Приготовьте буфер для восстановления, растворив 262 мМ NaHCO₃, 0,05 Н NaOH, 200 мМ HEPES в дистиллированной воде. Стерилизуйте раствор путем фильтрации через систему фильтрации на крышке бутылки 0,22 мкм в стерильную стеклянную бутылку. Аликвот 500 мкл восстановительного буфера в герметичные микроцентрифужные пробирки. Хранить при температуре 4 °C.
- Краситель для микроинъекций: растворите флуоресцентно меченный декстран в дистиллированной воде, свободной от РНКазы (конечная концентрация 10 мкг/мкл). Приготовьте 5 μL аликвот и храните при температуре -20 °C до использования.
- Извлеките пипетки для микроинъекций из капилляров из боросиликатного стекла (внешний диаметр 1,2 мм, внутренний диаметр 0,94 мм) с помощью съемника микропипеток. Защищайте пипетки от попадания пыли. Не храните пипетки более 2–3 дней. Для данного эксперимента параметры вытягивания были HEAT: температура рампы +1 – 5; ТЯГА: 100; ВЕЛ: 110; DEL: 100. HEAT и VEL — это параметры, которые в наибольшей степени влияют на форму и размер пипетки.
заметка: Оптимальная пипетка для микроинъекций имеет длинный и гибкий наконечник, что позволяет избежать повреждения клеток во время микроинъекций.
3. Подготовка среза ткани
- Растопите 3% агарозу широкого спектра с помощью микроволновой печи перед вскрытием мозговой ткани. Не допускайте затвердевания агарозы, выдерживая на водяной бане при температуре 37 °C перед закладкой. Убедитесь, что пипетки защищены от пыли. Не храните пипетки более 2–3 дней.
- Разморозьте аликвоту SCM и подогрейте 10–12 мл CIMM и 20 мл раствора Tyrode до 37 °C на водяной бане.
- Смешайте флуоресцентный индикатор (конъюгированный Dextran-3000 или Dextran-10000-Alexa; конечная концентрация 5–10 мкг/мкл) с другими химическими веществами, которые необходимо вводить. Центрифугируйте раствор для микровпрыска при 16 000 x g в течение 30 минут при 4 °C. Соберите надосадочную жидкость и переложите в новую пробирку. Держите раствор для микроинъекций на льду до использования.
- Используйте головы эмбрионов мыши E13.5–E16.5 для приготовления органотипических срезов ткани конечного мозга. Снимите кожу и вскройте череп с помощью щипцов, двигаясь по средней линии. Отделите мозг эмбриона от открытого черепа и удалите мозговые оболочки, покрывающие мозговую ткань, начиная с вентральной стороны мозга. Оставьте рассеченный весь мозг в растворе Тироде на нагревательном блоке при температуре 37 °C.
заметка: Все этапы диссекции, описанные в 3.4, должны быть выполнены в предварительно подогретом растворе Tyrode.
- Вылейте расплавленную агарозу широкого ассортимента в одноразовую закладную форму. Когда агароза остынет до 38–39 °C, осторожно перенесите в нее мозги (максимум 4) с помощью пастеровской пипетки. Всегда используйте кончики для среза на этом этапе.
- Перемешайте агарозу вокруг ткани с помощью шпателя или пары щипцов Dumont #1, не касаясь ткани. Дайте агарозе застыть при комнатной температуре. Как только агароза застынет, обрежьте излишки агарозы вокруг ткани.
- Заполните буферный лоток PBS. Ориентируйте мозг так, чтобы ростро-каудальная ось ткани была перпендикулярна лотку (используйте в качестве ориентира обонятельные луковицы, представляющие самую ростральную часть мозга). Нарежьте ломтики размером 250 мкм с помощью вибратома.
- Заполните чашку Петри диаметром 3,5 см 2 мл предварительно подогретого материала. С помощью пластиковой пастеровской пипетки переложите ломтики (10–15) в эту посуду. Как только это будет сделано, переместите чашку Петри с ломтиками в инкубатор для срезов. Выдерживайте ломтики при температуре 37 °C во влажной атмосфере, содержащей 40% O2 / 5% CO2 / 55% N2 до использования.
4. Микровпрыск
- Включите компьютер, микроскоп, камеру микроскопа, манипуляторы, напорную установку и датчик давления. Загрузите приложение, нажав на файл "launchapp.py" в главной папке, скачанной с GitHub, и укажите настройки устройства во всплывающем окне (инструкции по установке см. в шаге 1.1).
- Перед погружением пипетки в раствор создайте внешнее давление, чтобы предотвратить нежелательное засорение. Чтобы подать давление на пипетку, сдвиньте компенсационный стержень давления на 24–45% и нажмите «Установить значения». Затем настройте давление на достаточное давление, повернув ручку механического клапана давления на 1–2 PSI (69–138 мбар), как указано датчиком давления.
- Переложите ломтики в чашку Петри диаметром 3,5 см, содержащую 2 мл предварительно подогретого CIMM. Поместите ломтики, которые будут введены для микроинъекций, в центр чашки Петри. Переведите чашку Петри на предварительно разогретую (37 °C) ступень микровпрыска
.
- Загрузите в пипетку для микроинъекций 1,4–1,6 мкл микроинъекционного раствора (начиная с шага 3.3) с помощью пластиковой пипетки с длинным наконечником. Вставьте пипетку для микроинъекций в держатель пипетки.
- Используя наименьшее увеличение на микроскопе, сфокусируйте срез и направьте микропипетку в это поле зрения (FOV) так, чтобы она была сфокусирована в той же плоскости, что и мишень для среза. Переключите вывод микроскопа на камеру, чтобы увидеть поле зрения в приложении.
- Нажмите кнопку увеличения в левом верхнем углу интерфейса, чтобы начать калибровку устройства. Появится окно с предложением выбрать увеличение. Выберите 10-кратное увеличение или любое другое увеличение, на которое настроен объектив (например, 4x, 10x, 20x, 40x) и нажмите OK. Программное обеспечение предполагает, что внутреннее увеличение объектива имеет 10x (наиболее распространенное увеличение объектива).
- Перефокусируйте наконечник пипетки с помощью микрометрического колесика микроскопа и щелкните наконечник пипетки курсором. Далее нажмите кнопку step 1.1 и нажмите OK во всплывающем окне. Пипетка будет двигаться в направлении Y. Нажмите на кончик пипетки и нажмите кнопку шага 1.2. Наконец, введите 45 в поле Угол пипетки и нажмите кнопку Установить угол.
- Введите требуемые параметры на панель автоматического управления микровпрыском. Для микроинъекции в апикальные предшественники устанавливают расстояние инъекции 20–40 мкм и глубину 10–15 мкм. Для микроинъекции в нейроны устанавливают расстояние инъекции 30–40 мкм от базальной стороны, а глубину — 10–30 мкм в зависимости от того, на что нацеливается. Всегда устанавливайте скорость на 100%. Нажмите Установить значения.
заметка: Расстояние доступа — это расстояние, которое пипетка извлекает из ткани перед переходом на расстояние следующей инъекции, глубина — это глубина проникновения в ткань, на которую проходит микроинъекция, расстояние между последовательными инъекциями — расстояние вдоль линии между последовательными инъекциями, скорость — скорость пипетки в мкм/с.
- Нажмите кнопку «Нарисовать край» и перетащите курсор по нужной траектории во всплывающем окне, чтобы определить траекторию инъекции. При микроинъекции стволовых клеток-предшественников мишенью является вентральная сторона поверхности конечного мозга. Подведите пипетку к началу линии и нажмите на кончик пипетки. Нажмите Run trajectory, чтобы начать микроинъекцию. Повторите этот шаг для каждой целевой плоскости инъекции (обычно это делается для 3–4 плоскостей с 40–75 инъекциями в каждой плоскости).
