Методическая статья

Жидкостная хроматография с гидрофильным взаимодействием: метод разделения гидрофильных полярных аналитов с помощью гидрофильных шариков

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Liu, D., et al. Анализ N-гликана иммуноглобулина G с помощью ультраэффективной жидкостной хроматографии. J. Vis. Exp. (2020).

Это видео демонстрирует принцип разделения гидрофильных полярных соединений с помощью жидкостной хроматографии гидрофильного взаимодействия. Эта методика помогает в очистке различных полярных аналитов, в том числе N-гликанов.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Гидрофильная интерактивная хроматография и анализ гликанов

  1. Кондиционирование приборов УПЛК и подготовка подвижных фаз
    1. Приготовьте подвижные фазы, включающие растворитель А: 100 мМ формиат аммония (pH = 4,4), растворитель В: 100% ацетонитрил, растворитель С: 90% ультрачистой воды (10% метанола) и растворитель D: 50% метанола (сверхчистая вода).
    2. Откройте программное обеспечение для управления мобильными фазами.
    3. Промыть инструменты UPLC при расходе 0,2 мл/мин (50% растворителя В и 50% растворителя С) в течение 30 минут, затем при расходе 0,2 мл/мин (25% растворителя А и 75% растворителя В) уравновешивать в течение 20 минут, затем при расходе 0,4 мл/мин при балансировке.
  2. Растворите N-гликаны, предварительно меченные 2-аминобензамидом (2-AB), в 25 мкл смеси 100% ацетонитрила и ультрачистой воды в соотношении 2:1 (v/v). Затем центрифугируйте при 134 × г в течение 5 минут (4 °C) и загрузите 10 μL меченых N-гликанов в приборы UPLC.
  3. Отделяйте меченые N-гликаны со скоростью потока 0,4 мл/мин с линейным градиентом от 75% до 62% ацетонитрила в течение 25 минут. Затем проведите аналитический прогон с помощью калибровочной лестницы декстрана/гликопептидной колонки на UPLC при температуре 60 °C (здесь образцы хранились при температуре 4 °C перед инъекцией).
  4. Детектирование флуоресценции N-гликанов на длинах волн возбуждения и излучения 330 нм и 420 нм соответственно.
  5. Интегрируйте гликаны в зависимости от пикового положения и времени удержания.
  6. Рассчитайте относительную величину каждого пика гликана (GP)/всех пиков гликана (GPs) (процент, %) следующим образом: GP1: GP1/GPs*100, GP2: GP2/GPs*100, GP3: GP3/GPs*100 и т.д.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-аминобензамид, 2-АВSigma, Китай
АцетонитрилHuihai Keyi Technology Co., Ltd, Китай
Формиат аммонияПекин Минруида Технолоджи Ко., Лтд.
Калибровочная лестница для декстрана/колонка с гликопептидамиWatts technology Co., Ltd, Китай
Расширение возможностей 3.0Уотерс технолоджи Ко., Лтд, Америка
GlycoProfile 2-AB Набор для маркировкиSigma, Китай
метанолHuihai Keyi Technology Co., Ltd, Китай
Счетчик чистой воды Milli-QMillipore Co., Ltd, Америка202-2АВ
Пистолет для переноса жидкостиSmer Fell Science and Technology Co., Ltd, КитайПреимущество А10
Холодильник со сверхнизкой температуройThermo Co., Ltd, АмерикаПБ-10
Сверхэффективная жидкостная хроматографияWatts technology Co., Ltd, Китай
Вакуумный насосWatts technology Co., Ltd, Китай4672100, 0,5-10 мкл и 10-100 мкл и 20-200 мкл и 1000 мкл

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

HILICNUPLC

Похожие статьи