1. Флуоресцентная дериватизация сиаловых кислот
- Приготовьте 10 мл ОПД-раствора, состоящего из 100 мг о-фенилендиамина и 208 мг сероводорода натрия в 10 мл дистиллированного H₂O.
- Добавьте 20 мкл раствора OPD к образцам сиаловой кислоты. Энергично перебейте в течение 30 с и инкубируйте образцы в течение 4 ч при 80 °C в темноте (т.е. оберните микропробирки алюминиевой фольгой).
- Дайте образцам остыть в течение 5 минут, добавьте 80 μL дистиллированной H₂O и центрифугируйте пробирки при 14 000 x g в течение 1 минуты.
- Перелейте 80 мкл из надосадочной жидкости во флакон ВЭЖХ объемом 300 мкл с высокой степенью извлечения. Образцы дериватизированной сиаловой кислоты могут храниться при температуре 4-6 °C до одной недели.
2. Анализ производных сиаловой кислоты с помощью ВЭЖХ
- Анализируйте образцы с помощью стандартной системы ВЭЖХ, подключенной к онлайн-детектору флуоресценции.
- Для анализа используется колонка обратной фазы C18 со стандартными размерами 250 мм длиной и диаметром 4,6 мм.
- Готовят растворитель А путем разбавления 200 мл стокового раствора 800 мл воды класса LCMS (LCMS - жидкостная хроматография, масс-спектрометрия). Сам стоковый раствор можно приготовить следующим образом:
- Добавьте 46 г муравьиной кислоты к 800 мл H₂O класса LCMS.
- Отрегулируйте pH до 4,5, добавив по каплям раствор гидроксида аммония (puriss. p.a.).
- Переведите растворитель в мерный цилиндр и заполните до 1 000 мл H₂O класса LCMS. Этот исходный раствор можно хранить при температуре 4-6 °C до 3 месяцев.
- В качестве растворителя B используйте ацетонитрил класса LCMS.
- Отделите производные сиаловых кислот со скоростью потока 1 мл/мин со следующим градиентным элюированием:
- Начните с добавления 10% растворителя В, смешанного с растворителем А.
- От 0 мин до 15 мин постепенно увеличивайте долю растворителя В с линейным градиентом до 60%.
- С 15 мин до 16 мин быстро увеличивают долю растворителя В с линейным градиентом от 60% до 90%. Это инициирует промывку колонны ВЭЖХ.
- Для дальнейшей промывки колонки ВЭЖХ поддерживайте уровень растворителя B на уровне 90% в период от 16 до 18 минут, а затем постепенно снижайте уровень растворителя B до 10% в период от 18 до 19 минут.
- Восстановите равновесие в колонке ВЭЖХ до начальных условий 10% B между 19 и 24 минутами.
- Введите 50 мкл образца в систему ВЭЖХ.
- Контролируйте элюенты с помощью длин волн возбуждения/излучения флуоресцентного детектора 373/448 нм, и можно ожидать, что дериватизированные сиаловые кислоты будут находиться в приблизительном времени удержания 9 мин (для Neu5Gc-OPD) и 10 мин (для Neu5Ac-OPD).
- Вычислите относительное количество Neu5Gc (FNeu5Gc) из областей пика флуоресценции Neu5Ac (ANeu5Ac) и Neu5Gc (ANeu5Gc) следующим образом:
FNeu5Gc [%] = 100×ANeu5Gc/(ANeu5Ac+ANeu5Gc). В случае образцов молока и печени гомозиготной мыши с нокаутом Cmah FNeu5Gc должен составлять 0%, тогда как значения FNeu5Gc гетерозиготных мышей и мышей дикого типа могут сильно варьировать в зависимости от возраста мыши и типа ткани (от 2% до >90%) с ожидаемой погрешностью ±12%.