Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Измерение объема эмбриона с помощью вытеснения воды
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используются эмбрионы через 24 часа после оплодотворения (HPF) (Рисунок 1). Эмбрионы, используемые при измерении объема, не используются в анализе этанола.
- Поместите 10 эмбрионов и внеэмбриональную жидкость в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с маркировкой объемом 250 мкл (рис. 2А). Добавьте воду в заливную линию объемом 250 мкл (см. образец с окрашенной водой на рисунке 2B).
- Повторите шаг 1.1, чтобы подготовить вместилища для эмбрионов, у которых были удалены хорионы.
- Чтобы удалить хорион, поместите эмбрионы в хорионы в чашку Петри диаметром 100 мм с 2 мг/мл коктейля протеазы в эмбриональной среде при комнатной температуре (RT) на 10 минут. Каждые несколько минут аккуратно взбалтывайте эмбрионы, чтобы разбить хорион.
- Как только все эмбрионы освободятся от хориона, удалите дехорионированные эмбрионы из протеазного коктейля/эмбриональной среды и поместите в новую чашку Петри диаметром 100 мм со свежей средой для эмбрионов, чтобы промыть эмбрионы. Повторите этот шаг стирки еще 1 раз (всего 2 стирки). Перенесите эмбрионы в свежую чашку Петри диаметром 100 мм.
- Используя как можно меньший наконечник и не повреждая эмбрионы, осторожно удалите всю жидкость вокруг эмбрионов с помощью микропипеттора p200 (рис. 2C) и взвесьте воду весами с точностью до <0,1 мг. Чтобы определить объем образца из 10 эмбрионов, вычтите вес/объем воды (1 мл воды = 1 г воды), удаленной из 250 мкл. Чтобы определить объем одного эмбриона, разделите разницу между 250 мкл и весом удаленной воды на 10,<бр/>
2. Лечение эмбрионов этанолом
- Соберите эмбрионы из брачных емкостей и поместите в стандартную 100-миллиметровую чашку Петри. Отсчитывайте не более 100 эмбрионов на одну чашку Петри и инкубируйте при температуре 28,5 °C.
заметка: Если хорион должен быть удален (шаг 1.2), его необходимо удалить перед добавлением этанола.
- При 6 hpf добавьте до 100 эмбрионов в новую стандартную чашку Петри диаметром 100 мм либо с эмбриональной средой, либо с эмбриональной средой + 1% этанола (v/v). Накройте крышкой, но НЕ закрывайте чашку Петри. Поместите эмбрионы в инкубатор с низкой температурой, установленный при температуре 28,5 °C, на 18 часов или до тех пор, пока эмбрионы не достигнут точки времени развития 24 hpf.
3. Подготовка рабочего процесса перед обработкой эмбрионов для газовой хроматографии
- Приготовьте раствор 5 М NaCl в воде (потребуется 450 μл на пробирку с образцом), чтобы денатурировать все белки и предотвратить метаболизм этанола. Приготовьте коктейль из протеаз в концентрации 2 мг/мл в среде для эмбрионов.
- Промаркируйте пробирку для микроцентрифуги объемом 1,5 мл и флакон для газового хроматографа объемом 2 мл для каждого образца. Промаркируйте дополнительные флаконы газового хроматографа объемом 2 мл для стандартов этанола, описанных ниже, а также для воздуха, воды и заготовок для коктейлей 5 М NaCl/протеазы.
- Установите три микропипетки p200, две из которых настроены на 50 μл, а третья — на 200 μл; микропипеттор p1000 — на 450 μл и микропипеттор p2 — на 2 μл. Для стеклянных пипеток, используемых для переноса эмбрионов из чашек Петри в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, быстро пропустите наконечник пипетки через пламя, чтобы сгладить края и не повредить эмбрионы при втягивании их в пипетку.
4. Обработка эмбрионов для газовой хроматографии
ПРИМЕЧАНИЕ: Оба эмбриона в их хорионах и те, которые ранее были удалены из их хорионов, обрабатываются одинаково для согласованности в расчете коэффициентов разведения.
- С помощью двух микропипеток p200, установленных на 50 мкл, наберите 50 мкл раствора протеазного коктейля в один и наберите 50 мкл воды во второй.
- С помощью стеклянной пипетки и микропипетки быстро поместите 10 эмбрионов (начиная с шага 2.2) в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и закройте крышку (как описано на рисунке 2A). Повторите эти действия для всех образцов, подлежащих исследованию, контрольной группы и эмбрионов, обработанных этанолом.
- С помощью микропипетки p200, установленной на 200 мкл, быстро откройте колпачок и удалите всю остаточную среду эмбриона (как описано на рисунке 2C). Быстро поместите пипетку, содержащую 50 μл воды, в пробирку и быстро, но осторожно (чтобы не повредить эмбрионы) долей, а затем удалите воду. Быстро добавьте 50 μL раствора коктейля протеазы из ожидающей пипетки и закройте крышку пробирки (Рисунок 2D).
заметка: Выполняйте этот процесс по одному образцу за раз.
- Оставьте образец на RT в течение 10 минут, чтобы коктейль из протеаз разрушил хорион. Затем быстро добавьте 450 мкл 5 М NaCl и закройте крышку пробирки (рис. 2E). Переведите образцы на вихрь в течение 10 минут. Чтобы ускорить процесс, настройте микшер на одновременную обработку нескольких образцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте небольшое количество (~100 μл) смеси гранул кремнезема (2 размера, 0,5 мм и 1 мм шариков) в любую пробирку с эмбрионами старше 24 hpf. У более старых эмбрионов хорда останется неповрежденной независимо от того, как долго они гомогенизированы.
- После гомогенизации в течение 10 мин быстро удалите 2 мкл надосадочной жидкости гомогенизированного эмбриона и добавьте во флакон газового хроматографа. Быстро закройте флакон крышкой из политетрафторэтилена.
5. Подготовка стандартов на среды и этанол
- Для приготовления стандартов среды разбавьте среду в 10 раз 5 М раствором коктейля NaCl/протеаза. Добавьте по 2 мкл каждого образца в флакон с газовым хроматографом и закупорьте крышкой из политетрафторэтилена.
- Для приготовления стандартов этанола создают серийное разведение 100% этанола в 5 М растворе NaCl/протеазы коктейля до следующих концентраций: 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 и 40 мМ. Добавьте по 2 мкл каждого стандарта во флакон с газовым хроматографом и закупорьте крышкой из политетрафторэтилена.
6. Подготовка газовой хроматографии космического пространства
ПРИМЕЧАНИЕ: Газовая хроматография используется для количественной оценки уровней этанола, а не для разделения.
- Установите нагреватель для автосамплера на 58 °C и включите. Дайте нагревателю нагреться до 58 °C и включите воздушные и водородные газопроводы, питающие газовый хроматограф (для ионизации пламени, используемой для количественного определения этанола).
ПРИМЕЧАНИЕ: Фунт на квадратный дюйм должен быть настроен на правильную работу хроматографа в соответствии со спецификациями производителя. Убедитесь, что гелиевая линия включена и настроена на правильный фунт на квадратный дюйм.
- Что касается перегородки, убедитесь, что количество вводимых образцов не составляет >100. Для инъекционного волокна убедитесь, что количество вводимых образцов не составляет >500,<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Если количество инъекций превышает количество инъекций, их необходимо изменить перед запуском тестовых образцов.
- Включите программное обеспечение для анализа и убедитесь, что рабочая станция настроена правильно. Храните все данные в соответствии со стандартами лабораторий и отделов. Создайте новый список примеров для выполнения примеров.
- Запустите метод запуска и подождите, пока пламенно-ионизационный детектор стабилизируется, прежде чем запускать образцы. После стабилизации запустите метод запуска программного обеспечения для очистки волокна.
7. Измерения образцов с помощью газовой хроматографии
- После завершения метода запуска создайте по 1 новой строке для каждого образца в списке образцов. Из меню методов в программном обеспечении для анализа загрузите 436 Current spme ethanol 2013 3min absorb 2_5min rg run. МЕТАМФЕТАМИН для каждого образца в списке образцов.
- Заполните список образцов, начиная с воздуха, воды, 5 М NaCl/протеаз коктейльных заготовок. Затем вводим в нормы по порядку, от 0,3125 до 40 мМ. Следуйте стандартам со второй порцией заготовок для коктейлей из воздуха, воды и 5 M NaCl/протеазы.
- Введите все образцы надосадочной жидкости гомогенизированных эмбрионов для тестирования, от самой низкой до самой высокой прогнозируемой концентрации этанола. В конце войдите в третий и последний раунд заготовок для коктейлей воздух, вода и 5 М NaCl/протеаза.
- Добавьте флаконы газового хроматографа в автосамплер в том порядке, в котором были введены пробы. Дайте образцам нагреться в течение 10–15 минут. Запустите пробные прогоны в программном обеспечении.
- После того, как все образцы и окончательные заготовки будут выполнены, активируйте метод выключения в программном обеспечении, добавив окончательный образец в список образцов и запустив режим ожидания. МЕТ. Создайте резервную копию всех данных, полученных во время выборочных запусков. Выключайте оборудование в следующем порядке: нагреватель автосамплера, водородный бак и, только после того, как температура хроматографа достигнет 30 °С, воздушный бак. Оставьте гелиевый бак включенным, чтобы сохранить восковой столб.
8. Интегрирование пика этанола и анализ концентрации образца
ПРИМЕЧАНИЕ: Все значения, начиная с 8.3, были рассчитаны в файле Excel, который все уравнения предварительно заполнили.
- Как только метод выключения будет завершен, нажмите «Открыть хроматограмму». Откройте папку с результатами. Образцы автоматически интегрируются в эту программу.
- В результатах убедитесь, что интегрированы правильные пики (пики этанола от 2 до 2,5). После того, как все образцы будут подтверждены, распечатайте или экспортируйте результаты.
- Нанесите на график пиковую высоту стандартов этанола. Рассчитайте наклон, пересечение Y и значения R2 для стандартов этанола (R2 должно быть >0,99).
заметка: Эти значения будут использоваться для определения концентрации этанола от пиковой высоты образца.
- Для каждого образца вычтите пиковую высоту образца из Y-пересечения стандартов этанола. Разделите это значение на наклон стандартов этанола, чтобы получить значение этанола для каждого образца в флаконах GC.
- Чтобы рассчитать концентрацию этанола в эмбрионах, сначала рассчитают коэффициент разбавления для каждого образца. Возьмите меру объема, рассчитанную на шаге 1.3 настоящего протокола, и разделите ее на меру объема плюс 500 μл. Это представляет собой 5 М раствор коктейля NaCl/протеазы, добавляемый в каждый образец во время обработки эмбриона (этапы 4.3 и 4.4).
- Используя этот коэффициент разбавления образца, умножьте на значение этанола образца для каждого образца. Результаты будут в концентрации в мМ. Расчет эталонных образцов среды путем умножения значения этанола в среде на коэффициент разбавления 10,
