Электрофорез в полиакриламидном геле: аналитический метод обнаружения гепарановых сульфатов различной длины цепей, выделенных из легочной ткани мыши

Аннотация

Источник: LaRiviere, W. B. et al., Обнаружение гликозаминогликанов с помощью электрофореза полиакриламидным гелем и окрашивания серебром. J. Vis. Exp. (2021)

Это видео демонстрирует процедуру разделения гепарановых сульфатов, выделенных из легочной ткани мыши, с помощью электрофореза полиакриламидным гелем.

Протокол

1. Электрофорез в полиакриламидном геле выделенных и очищенных гликозаминогликанов

1. Заранее приготовьте растворы, необходимые для электрофореза в полиакриламидном геле (ПЕЙДЖ) (табл. 1). <бр/> заметка: Выбирайте процентное содержание акриламида растворяющегося геля в зависимости от размера гликозаминогликанов, которые должны содержаться в образце. 15% рекомендуется для разрешения более крупных фрагментов (более 30 дисахаридных субъединиц в длину); 22% для более мелких фрагментов (<20 дисахаридных субъединиц в длину).
2. Поместите пустую кассету в бак PAGE. Слейте разрешающий гель следующим образом: В 15 мл тюбика смешайте 10 мл раствора разрешающего геля, 60 мкл 10% персульфата аммония (должен быть свежеприготовленным) и 10 мкл TEMED (добавьте TEMED в последнюю очередь). Аккуратно переверните трубку в 2-3 раза. С помощью пипетки быстро добавьте вышеуказанный раствор объемом 10 мл в кассету. Посыпьте 2 мл деионизированной, отфильтрованной воды и дайте растворяющему гелю полимеризоваться в течение 30 мин. <бр/> заметка: Следующий протокол PAGE был оптимизирован для вертикальной системы PAGE с использованием литейных кассет толщиной 13,3 x 8,7 см (ширина x длина) 1,0 мм общим объемом около 12 мл. Можно использовать и другие кассетные системы, но они могут потребовать оптимизации со стороны конечного пользователя.
3. После того, как растворяющий гель полностью полимеризуется, слейте покрытую воду и отлите укладывающий гель следующим образом: в пробирке объемом 15 мл смешайте 3 мл раствора укладывающего геля, 90 мкл 10% персульфата аммония (должен быть свежеприготовленным), 3 мкл TEMED (добавьте TEMED в последнюю очередь).
4. Аккуратно переверните трубку в 2-3 раза. С помощью пипетки быстро нанесите раствор укладывающегося геля на застывший разрешающий гель; Заполните кассету до краев. Полностью вставьте расческу, входящую в комплект поставки. Дайте гелю полимеризоваться в течение 30 минут.
5. После того, как гель полимеризуется, убедитесь, что полоса ленты удалена со дна кассеты, и поместите кассету обратно в узел бака PAGE.
6. Заполните верхнюю и нижнюю камеры буфером верхней и нижней камер соответственно.
7. Высушенные образцы с шага 1.11.4 растворить в минимально необходимом объеме деионизированной, отфильтрованной воды (не более, 50% от объема лунок в геле PAGE). Смешайте 1:1 с буфером для загрузки образца. Загрузите образцы и «лестницы» из олигосахаридов HS (см. таблицу 1) в гель.
8. Предварительно запустите гель в течение 5 минут при 100 В. Затем проведите гель при напряжении 200 В в течение 20-25 мин (для 15% полиакриламидного растворяющего геля), 40-50 мин (для 18% полиакриламидного растворяющего геля), 90-100 мин (для 22% полиакриламидного разрешающего геля).
   заметка: Может потребоваться некоторая оптимизация времени работы при напряжении 200 В. феноловый красный мигрирует впереди гепариновых олигосахаридов, которые имеют длину 2 полимерные субъединицы (т.е. степень полимеризации 2, или dp2); Бромфенол синий мигрирует раньше DP10-DP14. Наилучшие результаты достигаются при подаче напряжения таким образом, что фенольная красная полоса мигрирует почти, но не совсем, на дно геля. Соответствующим образом отрегулируйте время выполнения.

Результаты

Таблица 1: Растворы, необходимые для электрофореза в полиакриламидном геле очищенных гликозаминогликанов. Все растворы перед применением должны быть отфильтрованы (0,22 мкм).

ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворы должны быть отфильтрованы (0,22 мкм) перед использованием.
решение	рецепт

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Персульфат аммония (твердый)	ThermoFisher Scientific	БП179-25	Степень электрофореза
Система очистки воды Barnstead GenPure Pro	ThermoFisher Scientific	10-451-217ПКГ	Любая система деионизации/очистки воды является приемлемой заменой
Борная кислота (твердая)	ThermoFisher Scientific	А73-500	Класс молекулярной биологии
Бромфенол синий (твердый)	ThermoFisher Scientific	В392-5
Критерий пустой кассеты для PAGE (толщина 1,0 мм, 12+2 лунки)	Био-Рад	3459901	Подойдет любая литейная кассетная система PAGE толщиной 1,0 мм
Система ячеек Criterion PAGE (ячейка и блок питания)	Био-Рад	1656019	Подойдет любая сопоставимая вертикальная гелевая система PAGE)
Динатриевая соль ЭДТА (твердая)	ThermoFisher Scientific	02-002-786 (Английский	Класс молекулярной биологии
Глицин (твердый)	ThermoFisher Scientific	Г48-500	Степень электрофореза
Соляная кислота (жидкая)	ThermoFisher Scientific	А466-250
N,N'-метилен-бис-акриламид (твердый)	ThermoFisher Scientific	БП171-25	Степень электрофореза
Фенол красный (твердый)	ThermoFisher Scientific	П74-10	Свободная кислота
Сахароза (твердая)	ThermoFisher Scientific	БП220-1	Класс молекулярной биологии
TEMED (N,N,N',N'-тетраметилендиамин)	ThermoFisher Scientific	БП150-20	Степень электрофореза
Основание Tris (цельное)	ThermoFisher Scientific	БП152-500	Класс молекулярной биологии
Вакуумный фильтрующий блок, одноразовый, 0,22 мкМ пор PES, объем 500 мл	ThermoFisher Scientific	569-0020	Альтернативные объемы и приемлемые фильтрующие материалы
Акриламид (твердый)	ThermoFisher Scientific	БП170-100	Степень электрофореза
Гепарин, полученный из декасахарида (dp10)	Научный Гален	ХО10
Гексасахард, полученный из гепарина (dp6)	Научный Гален	ХО06
Гепарин, полученный из олигосахарида (dp20)	Научный Гален	ХО20

)