Электрофорез полиакриламидного геля додецилсульфата натрия для анализа белков: метод разделения и визуализации белков на основе молекулярной массы

Аннотация

Источник: Sultana, S. et al. Экстракция и визуализация белковых агрегатов после лечения кишечной палочки протеотоксическим стрессором. J. Vis. Exp. (2021).

Это видео демонстрирует метод разделения белков на основе денатурирующего полиакриламида. Эта методика помогает в предварительной идентификации белков на основе их молекулярной массы.

Протокол

1. Разделение и визуализация агрегатов экстрагированного белка с помощью SDS-PAGE

1. Приготовьте 12% SDS-полиакриламидный гель
   1. Для двух разделительных гелей пипетку нанесите 5,1 мл воды двойной дистилляции (ddH₂O), 3,75 мл Tris-HCl (pH 8,8), 7,5 мл 20% (w/v) SDS, 6 мл 30% раствора акриламида/бисакриламида (29:1), 75 мл 10% w/v персульфата аммония и 10 мл тетраметилэтилендиамина (TEMED) в центрифужную пробирку объемом 15 мл и аккуратно перемешайте, не вводя пузырьков воздуха. Налейте гель с помощью пипетки объемом 1 мл внутрь стеклянных пластин, оставив верхние 2 см свободными от смеси. Добавьте 70% этанола в верхнюю часть разделительного геля и обеспечьте равномерное соприкосновение между двумя слоями.
   2. После полимеризации разделительного геля готовят стекирующий гель путем пипетирования 1,535 мл ddH₂O, 625 мл Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 мл 20% (w/v) SDS, 335 мл 30% раствора акриламида/бисакриламида (29:1), 12,5 мл 10% w/v персульфата аммония и 2,5 мл TEMED. Удалите этанол из разделительных гелей и добавьте раствор укладывающего геля. Вставьте расческу с нужным количеством карманов без введения пузырьков воздуха. Дайте полимеризации в течение 20-30 минут.
2. Загрузите по 4 мкл каждого образца и белкового трапа в отдельные лунки и запустите гель (гели) в проточный буфер Трис-глицина (Таблица 1) при напряжении 144 В в течение 45 минут при комнатной температуре.
   заметка: Остановите прием геля, когда бромфенольная полоса вот-вот выйдет из геля.
3. Окрасьте гель (гели) в предварительно подогретый раствор Fairbanks A (Таблица 1) на 30 минут на коромысле.
4. Обесцвечивайте гель (гели) в предварительно подогретом растворе Fairbanks D (Таблица 1) до появления желаемого фона (например, на ночь) на качалке.

Результаты

Решения	Рецепты
Буфер А	10 мМ фосфата калия (pH 6,5), 1 мМ ЭДТА
Буфер B	Буфер А, содержащий 2% нонидета Р-40. Можно хранить при комнатной температуре для последующего использования.
Fairbanks A (Раствор для окрашивания)	25% изопропанол, 10% ледяная уксусная кислота, 1,4 г ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Химикаты/Реагенты
ацетон	Научный центр Фишера	Тел.: 67-64-1 (английский
30% раствор акриламида/бисаакриламида 29:1	Био-Рад	1610156
Персульфат аммония	Миллипора Сигма	А3678-100Г
Bluestain 2 Протеиновая лестница, 5-245 кДа	ГолдБио	П008-500
β-меркаптоэтанол	Миллипора Сигма	М6250-100МЛ
Бромфенол синий	ГолдБио	Б-092-25
Кумасси Бриллиантовый Синий R-250	ООО «МП Биомедикалс»	821616
Этилендиамин тетрауксусная кислота (ЭДТА)	Сигма-Олдрич	SLBT9686
Ледяная уксусная кислота	Миллипора Сигма	ARK2183-1л
Глицерин, 99%	Сигма-Олдрич	Г5516-1Л
глицин	ГолдБио	Г-630-1
Изопропанол (2-пропанол)	сигма	402893-2,5 л
10x буфер MOPS	Текнова	М2101
Додецилсульфат натрия (SDS)	Сигма-Олдрич	Л3771-500Г
Тетраметилэтилендиамин (TEMED)	Миллипора Сигма	Т9281-50МЛ
База Tris	ГолдБио	Т-400-1
Материал/Оборудование
электропитание	ThermoFisher Scientific	ЕС105
рокер	Щелочные научные	РС7235
Маленькая стеклянная пластина	Био-Рад	1653311
Распорные пластины (1 мм)	Био-Рад	1653308
спектрофотометр	Теплонаучные	3339053
Настольная центрифуга для центрифужных пробирок объемом 15 мл	Бекман-Култер
Вертикальная камера гель-электрофореза	Био-Рад	1658004
Вортексер	Фишер Вихрь Джинн 2	Телефонный номер 12-812
Термомиксер	Бенчмарк Научная	Н5000-НС
10 луночный гребень	Био-Рад	1653359

)