Электрофорез в геле из полиакриламида мочевины для анализа РНК: метод отделения флуоресцентно меченных фосфорилированных олигонуклеотидов РНК от их нефосфорилированных эквивалентов

Аннотация

Источник: Pillon, M. C., et al., Нерадиоактивный анализ для измерения полинуклеотидного фосфорилирования малых нуклеотидных субстратов. J. Vis. Exp. (2020)

В этом видео мы демонстрируем денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле для отделения фосфорилированных РНК от их нефосфорилированных аналогов. Виды РНК флуоресцентно помечены для лазерного обнаружения на геле.

Протокол

1. Гель-электрофорез

1. Приготовьте 15% раствор акриламида/8 М геля мочевины.<бр/> осторожность: С акриламидом нужно обращаться осторожно, потому что он является нейротоксином. При работе с ним всегда надевайте перчатки, лабораторный халат и защитные очки.
   1. В стеклянном стакане объемом 150 мл смешайте 22,5 мл предварительно смешанного 40% раствора акриламида/бис-акриламида 29:1, 6 мл 10x TBE, 28,8 г мочевины и воды без РНКазы до общего объема 59 мл. Аккуратно перемешайте раствор.
      заметка: В зависимости от длины субстрата РНК, изменение процентного содержания полиакриламида может улучшить разрешение между нефосфорилированной и фосфорилированной РНК.
   2. Чтобы растворить мочевину, нагрейте раствор в микроволновой печи в течение 20 с, перемешайте жидкость и сразу же поместите раствор обратно в микроволновую печь еще на 20 с. Аккуратно помешивайте раствор до полного растворения мочевины.
   3. Медленно охладите раствор, поместив стеклянный стакан на неглубокую водяную баню с холодной водой. Убедитесь, что уровень холодной воды вокруг стеклянного стакана выше уровня раствора внутри стеклянного стакана. Это будет способствовать эффективному теплообмену. Ожидание 5 мин.<бр /> заметка: Не продолжайте следовать этому протоколу, если стеклянный стакан кажется теплым; вода должна быть ниже 25 °C. Если через 5 минут она все еще остается теплой, замените воду на водяной бане свежей холодной водой и подождите еще 5 минут.
   4. Отфильтруйте и дегазируйте раствор с помощью одноразовой фильтрующей установки 0,22 мкм для удаления твердых частиц и микроскопических пузырьков воздуха.
2. Налейте денатурирующий гель
   1. С помощью мыла и теплой воды очистите короткую и длинную стеклянную пластину, предназначенную для гелей, с общими размерами 31,0 см x 38,5 см. Распылите на каждую стеклянную пластину 95% этанола и протрите стекло, чтобы удалить влагу><. заметка: Одна из двух пластин может быть силиконизирована, чтобы предотвратить повреждение геля при отделении стеклянной пластины. Однако этот шаг не является необходимым, поскольку этот протокол предназначен для визуализации РНК без разделения стеклянных пластин.
   2. Поставьте длинную стеклянную тарелку горизонтально на коробку так, чтобы она была приподнята над столешницей.
      осторожность: Акриламид токсичен, поэтому станция заливки геля должна быть покрыта скамьейной бумагой, способной впитать любую пролитую жидкость, и сразу же после завершения процедуры должна быть помещена в мешок для мусора.
   3. Поместите чистую распорку 0,4 мм вдоль длинных краев длинной стеклянной пластины.
   4. Положите короткую стеклянную пластину поверх длинной пластины и убедитесь, что края короткой пластины, длинной пластины и распорок выровнены. Зажмите каждую сторону с помощью трех равномерно расположенных металлических зажимов.
   5. Добавьте 24 мкл TEMED в 15% раствор акриламида/8 М мочевины, приготовленный на шаге 3.1, и перемешайте.
   6. Добавьте в раствор 600 μL 10% (w/v) APS на шаге 1.2.5 и аккуратно перемешайте раствор.
   7. Сразу же налейте раствор между стеклянными пластинами.
      заметка: Чтобы избежать образования пузырей, постукивайте по стеклу во время заливки раствора.
   8. Осторожно добавьте чистый, 0,4 мм, 32 хорошо гребень в верхнюю часть стеклянной тарелки бутерброда.
   9. Дайте акриламиду не менее 30 минут, чтобы он успел полимеризоваться.
3. Запустите денатурирующий гель
   1. Установите нагревательный блок на 75 °C.
   2. Снимите металлические зажимы, удерживающие сэндвич со стеклянной пластиной, и тщательно вымойте и высушите сэндвич со стеклянной пластиной.
   3. Поместите сэндвич со стеклянной пластиной в гелевый аппарат короткой пластиной внутрь.
   4. Приготовьте рабочий буфер 0,5x TBE, смешав 100 мл 10x TBE с 1,9 л воды, не содержащей РНКазы. Добавьте 600 мл бегового буфера в верхнюю и нижнюю камеры гелевого аппарата.
   5. Аккуратно снимите расческу и тщательно промойте лунки с помощью шприца. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение для удаления мочевины из лунок.
   6. Предварительно запустите гель в течение 30 минут при мощности 50 Вт. Напряжение составляет около 2 000 В. ВНИМАНИЕ: Этот гелевый аппарат работает с высокой мощностью, и пользователи должны проявлять осторожность.
   7. Тщательно промойте лунки с помощью шприца.<бр/> заметка: Этот шаг имеет решающее значение для равномерной загрузки образца в скважины.
   8. Импульсное вращение затухает реакцией. Затем инкубируйте пробирки при температуре 75 °C в течение 3 минут. Повторите импульсное вращение.
   9. Немедленно загрузите 10 мкл образца в лунку и запустите гель в течение 3 ч при 50 Вт<бр/> заметка: Флуоресцентно меченая РНК чувствительна к свету; Поэтому накройте гелевый аппарат фольгой.
4. Представьте себе денатурирующий гель.
   1. Отключите электропитание и слейте воду из верхней камеры гелевого аппарата.
   2. Вымойте и высушите внешнюю сторону стеклянной тарелки бутерброда с мылом и водой. Накройте стеклянную тарелку бутербродом фольгой во время транспортировки геля.
   3. Установите сэндвич из стеклянной пластины на столик лазерного сканера, способного количественно и чувствительно детектировать флуоресценцию.
      заметка: Этот гель чрезвычайно тонкий для максимального разрешения. По этой причине данный протокол разработан таким образом, чтобы избежать трудностей, связанных с удалением геля из сэндвича со стеклянной пластиной, путем прямой визуализации флуоресцентно меченной РНК через стеклянные пластины. Использование коммерчески доступных пластин из низкофлуоресцентного стекла позволит увеличить захваченный сигнал за счет улучшения отношения сигнал/шум.
   4. Установите длины волн возбуждения и излучения лазерного сканера для нужного флуорофора.
      заметка: Оптимальные длины волн возбуждения и излучения могут отличаться для конкретных флуорофоров. Для флуорофора FAM длины волн возбуждения и излучения составляют 495 нм и 535 нм соответственно.
   5. Определите визуализируемую область на предметном столике лазерного сканера и нанесите изображение геля в соответствии с инструкциями производителя (рис. 1).

Результаты

Figure 1: <strong style="font-size: 13px;">Пример анализа денатурирующего геля фосфорилированной РНК. Анализ РНК-киназы in vitro Las1-Grc3 (110 нМ) инкубирован с 500 нМ РНК SC-ITS2. X обозначает контрольную реакцию без Las1-Grc3, а черный треугольник представляет титрование АТФ от 0 до 10 мМ. РНК C2 является результатом ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,4 мм 34-луночный гребень	БиоРад	1653848
Прокладка 0,4 мм	БиоРад	1653812
0,5 М ЭДТА ph 8.0	КД Медикал	РГФ-3130
1М хлорид магния	КД Медикал	САС-5290
1М Трис pH 8,0	КД Медикал	РГФ-3360
40% раствор акриламида/биса 29:1	БиоРад	1610146
5М хлорид натрия	КД Медикал	РГФ-3720
персульфат аммония (APS)	БиоРад	Телефонный номер 161-0700
СПС	сигма	А2383-1Г
борная кислота	сигма	В0394
Бромфеноловая синяя натриевая соль	сигма	Б5525-5Г
Стеклянные пластины	Томас Сайенти	1188К51
Секвенсор Hoefer SQ3	Хофер	Н/Д
Программное обеспечение Image J	Н/Д	Н/Д	https://imagej.nih.gov/ij/
Меченые РНК-олигонуклеотиды	IDT	Индивидуальный заказ
Блок питания Pharmacia EPS 3500	Аптека	Н/Д
Steriflip 0. 22 мкм Фильтр	Многородность	5ФКП00525
ТЕМЕД	БиоРад	Телефонный номер: 161-0800
База Tris	сигма	ТРИС-РО
Тайфун FLA 9500 гелевый имиджер	GE Healthcare	Н/Д
Ультрачистая вода DEPC	Инвитроген	750023
Ультрачистый глицерин	Инвитроген	19Э1056865
мочевина	Фишер Кемикал	У15-500