Двумерный электрофорез в полуденатурирующем агарозном геле: методика разделения полиморфных волокон амилоидов на основе размерной неоднородности

Аннотация

Источник: Hanna-Addams, S., et al. использование двумерного полуденатурирующего детергентного электрофореза в агарозном геле для подтверждения гетерогенности размеров амилоидных или амилоиподобных волокон. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео демонстрирует разделение амилоидных волокон на основе двумерного полуденатурирующего детергента, основанного на электрофорезе агарозного геля. Метод разделяет полиморфные амилоидные агрегаты на основе их гетерогенного размера.

Протокол

1. Подготовка образцов

1. Культура 2 x 10⁶ амилоидных клеток рака толстой кишки HT-29 в 10-сантиметровой чашке для культуры тканей в 10 мл модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и пенициллин-стрептомицин. Культивирование клеток в течение ночи в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%_CO2.
   1. После того, как клетки вырастут до 80% конфлюенции, промойте клетки 10 мл фосфатно-солевого буфера (PBS). Добавьте 3 мл раствора трипсина и инкубируйте при 37 °C в течение 3 минут.
   2. После того как клетки будут полностью отделены от чашки, добавьте 10 мл питательной среды и перенесите клетки пипеткой объемом 10 мл в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте клетки при давлении 1000 x g в течение 3 мин при комнатной температуре. Аспирируйте среду, ресуспендируйте клетки в 5 мл питательной среды и подсчитайте клетки с помощью клеточного счетчика. Тарелка 2 х 10^{по 6} ячеек в каждой по две 10-сантиметровые посуды.
   3. Дайте клеткам прилипнуть и восстановиться в течение ночи в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%_CO2. Применяйте лечение в одной чашке, чтобы индуцировать образование амилоидов с 20 нг/мл фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α), 100 нМ Smac-миметика и 20 мкМ ингибитора панкаспазы Z-VAD-FMK. Комбинация сокращенно обозначается как TSZ. Обработайте другую тарелку с помощью транспортного средства в качестве контроля.
2. По прошествии соответствующего промежутка времени, обычно 6 часов, соберите лизат клеток.
   1. Соскребите клетки с планшета пластиковым скребком и с помощью пипетки объемом 10 мл переложите их в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте ячейки при давлении 1 000 x g в течение 3 мин при 4 °C.
   2. Промойте клетки 2 раза, повторно суспендируя в 10 мл ледяного PBS и центрифугируя при 1000 x g в течение 3 мин при 4 °C. Отсадите раствор PBS><. заметка: Здесь процесс можно приостановить, заморозив клеточную гранулу в жидком азоте и храня при температуре ˗80 °C до 1 месяца.
   3. Переложите клеточную гранулу в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и инкубируйте в 0,3 мл буфера для лизиса в течение 30 минут на льду. Центрифуга при 20 000 x g в течение 15 минут при 4 °C. Надосадочная жидкость — это лизат всей клетки.
      заметка: Здесь процесс можно приостановить, сохранив образец при температуре -20 °C до нескольких месяцев.
   4. Измерьте концентрацию белка с помощью теста Брэдфорда. Добавьте 4x загрузочный буфер SDD-AGE для подготовки 20 мкл образца 3 мкг/мкл и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут.

2. Подготовка и запуск гелей

1. Добавьте 2 г агарозы к 200 мл 1x трис-ацетатного буфера (TAE) в стеклянную мензурку и нагрейте в микроволновой печи, чтобы агароза расплавилась. Добавьте 1 мл 20% SDS для получения конечной концентрации 0,1% SDS. Осторожно перемешайте, чтобы перемешать. Будьте осторожны, чтобы не образовались пузыри после добавления паспорта безопасности.
2. Налейте раствор агарозы в гелевую плиту размером 15 см х 14 см. Используйте пипетку объемом 1 мл, чтобы удалить любые пузырьки. Поместите одну 20-луночную расческу наверху.
3. Первое измерение: Пипетка 60 мкг лизата цельных клеток в крайней правой полосе. Запустите гель при напряжении 60 В в течение примерно 4 ч (пока фронт красителя не пройдет через гель примерно на 3/4), используя TAE, содержащий 0,1% SDS, в качестве буфера для работы.
4. Второе измерение: Осторожно поверните гель на 90° против часовой стрелки (Рисунок 1A). Запустите гель при напряжении 60 В в течение примерно 4 ч.<бр/> заметка: Общее рабочее условие составляет 4 В/см длины геля. Важно, чтобы условия работы были абсолютно одинаковыми для первого и второго измерений.

Результаты

Рисунок 1. Протокол эксперимента.(А) Схема двумерного полуденатурирующего детергентного электрофореза в агарозном геле (2D SDD-AGE). Начните с загрузки образца в крайнюю правую полосу, помеченную красным цветом. После окончания первого прогона измерения поверните гель на 90° против часовой стрелки. Запустите электрофорез второго измерения. Сплошная стрелка указывает направление первого прогона размера,...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Установка для гелевого электрофореза	рыбак	HE99XPRO	Appratus для гелевого бега.
Агроза	ВВР	97062-250	Для агарозного геля.
DMEM	сигма	Д6429	для клеточных культур
Фетальная бычья сыворотка	сигма	Ф4135	для клеточных культур
пеницилин-стрептомицин	сигма	П4333	для клеточных культур
Раствор трипсина	сигма	Т4049	для клеточных культур
PBS для культуры тканей	сигма	Д8662	для клеточных культур
рекомбинантный ФНО	Сделано в нашей лаборатории		для индуцирования некроптоза. Смотрите ссылку 11.
СМАП-миметик	подарок от доктора Сяодун Вана		для индуцирования некроптоза. Смотрите ссылку 11.
ЗВАД-ФМК	АпексБио	А1902	для индуцирования некроптоза. Смотрите ссылку 11.
Счетчик ячеек	Био-Рад	1450102	Модель TC20; для счетных ячеек
Набор для анализа белка BCA от Pierce™	Термо Сайентиал	No 23225	для измерения концентрации белка в клеточных лизатах
Лифтер ячеек	рыбак	Тел.: 07-200-364	для удаления клеток из чашки
Буфер для лизиса (1 л)			20 мл 1 М Tris pH 7,4 10 мл глицерина 30 мл 5 М NaCl 840 мл ddH2O 10 мл Triton-X100 (ингибиторы протеазы и фосфатов по желанию)
10X ТАЭ (1 л)			48,4 г Tris base 11,42 мл ледяной уксусной кислоты 20 мл 0,5М ЭДТА pH 8<бр/> ddH20 до 1 л
4 загрузочных буфера SDD-AGE (50 мл)			5 мл 10X TAE 10 мл глицерина 4 мл 20% SDS 0,5 мл 10% бромфенол синий<бр /> 31 мл ddH2O
Буфер для стирки PBST (1 л)			100 мл 10xPBS 800 мл ddH2O 1 мл Tween20
10X PBS (10 л)			800 г NaCl 20 г KCl 144 г Na2HPO4·2H2O 24 г KH2PO4<чел. /> добавьте ddH2O до 10 л