Multimer-PAGE для разделения нативных белковых комплексов: гибридная методика разделения, состоящая из Blue Native-PAGE и SDS-PAGE для выделения интактных мультимерных белков из лизата тканей

Abstract

Источник: Rhinesmith, T. et al., Multimer-PAGE: метод захвата и разрешения белковых комплексов в биологических образцах. J. Vis. Exp. (2017).

Это видео описывает мультимерную СТРАНИЦУ для отделения нативных белковых комплексов от тканевых гомогенатов. Техника представляет собой гибрид синих техник native-PAGE и SDS-PAGE. Разделенные комплексы могут быть охарактеризованы и изучены на предмет их роли в функционировании клеток.

Protocol

1. Подготовка тканей

1. Приготовьте 10 мл 4x BN-PAGE буфера для проб (200 мМ бис(2-гидроксиэтил)амино-трис(гидроксиметил)метана (Бис-трис), 200 мМ NaCl, 40% мас./об. глицерина, 0,004% Ponceau S, pH 7,2).
   заметка: Этот исходный раствор может быть изготовлен заранее и храниться при температуре 4 °C.
2. Разведите 250 мкл 4x буфера для образца в 750 мкл dH₂O, содержащем 1x коммерческий коктейль ингибиторов протеазы. Вихрь и охлаждение на льду.
3. Гомогенизируйте 20 мг ткани-мишени в 1 мл 1x ледяного буфера для образцов BN-PAGE с помощью 30 нажатий чистого гомогенизатора.
   заметка: Для этого демонстрационного эксперимента целевой тканью является целая ткань мозга крысы. После гомогенизации образцы могут быть обработаны мягким моющим средством, таким как 2% дигитонин, для солюбилизации и обеспечения электрофореза мембранных белков.
4. Переложите гомогенат в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте при 14 000 x g в течение 30 минут, чтобы гранулировать нерастворимое клеточное содержимое. После центрифугирования сцедите надосадочную жидкость в чистую пробирку на льду.
5. Следуйте инструкциям производителя для измерения концентрации белка надосадочной жидкости с использованием бицинхониновой кислоты (BCA) или аналогичного анализа количественного определения белка.
6. Если образец (образцы) гомогената содержит моющее средство, добавьте 5% Coomassie Blue G-250 в водный раствор, достаточный для доведения гомогенатного раствора до 0,25% Coomassie.

2. BN-СТРАНИЦА

1. Разбавьте 25 мл 20x blue native (BN) электрофорезного буфера (1,0 М Бис-Трис, 1,0 М трицина, pH 6,8) в 475 мл dH₂O, содержащем 0,002% Coomassie blue, чтобы получить 500 мл 1x работающего буфера.
   1. Если образцы содержат моющее средство, вместо этого сделайте 250 мл 1x бегового буфера, содержащего 0,02% кумасси, и еще 250 мл без него.
2. Охладите буфер (буферы) до 4 °C.
3. Очистите и соберите кассету для заливки полиакриламидного геля в соответствии с инструкциями производителя.
4. Налейте полиакриламидный гель BN (слой укладки 3% Т, растворяющий слой 6% Т) по стандартному рецепту и поместите расческу в лунку.
5. После того как гели полимеризуются, промойте кассету с помощью dH₂O и соберите аппарат для электрофореза в соответствии с инструкциями производителя.
6. Снимите гребень колодца и заполните лунки 1x BN-PAGE рабочим буфером. Избегайте заполнения всей внутренней камеры буфером до тех пор, пока образцы не будут загружены.
   1. Если образцы содержат моющее средство, заполните лунки буфером, содержащим 0,02% Coomassie Blue.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 2,7-2,9 при 4 °C.
7. С помощью гелеобразных наконечников пипеткой введите объем гомогената, содержащего 20 мкг белка, в нужные лунки. Пипетка эквивалентного объема 1x BN-PAGE буфера для проб во все неиспользуемые лунки.
   заметка: Используйте концентрацию белка, определенную с помощью анализа BCA, чтобы рассчитать подходящий объем гомогената для добавления в лунки.
8. После загрузки образцов заполните внутреннюю камеру 1x рабочим буфером BN-PAGE. Убедитесь, что гель полностью погружен в буфер. Далее заполните внешнюю камеру 1x ходовым буфером до уровня, указанного производителем.
   1. Если образцы содержат моющее средство, заполните внутреннюю камеру 1x буфером, содержащим 0,02% Coomassie Blue, а внешнюю камеру 1x проточным буфером без красителей.
9. Подключите электроды к источнику питания и электрофорируйте белки в геле при напряжении 150 В, пока полоса красителя не продвинется на ~2 см в разрешающий слой. Остановите и отключите источник питания.

3. Перекрестные ссылки

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 3.1-3.6 при 4 °C.

1. Разберите аппарат для электрофореза и отделите стекла гелевой кассеты. Снимите и выбросьте слой укладки.
2. Аккуратно разрежьте гель чуть ниже нижнего края лицевой стороны красителя. Позаботьтесь о том, чтобы этот разрез был как можно более ровным и прямым, а затем выбросьте неиспользованный кусок геля. В результате останется горизонтальная полоска полиакриламидного геля шириной ~2 см, которая будет содержать весь белок в образце гомогената.
3. Обрежьте все неиспользованные участки по краям гелевой полоски.
4. Осторожно поместите полоску в 10 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) в небольшую емкость и аккуратно перемешайте в течение 30 минут, чтобы сбалансировать.
5. После уравновешивания выбросьте и замените PBS еще на 10 мл. Пипетку объемом 500 мкл 25 мМ DSP растворить в диметилсульфоксиде в PBS и продолжить перемешивание, как описано выше (шаг 3.4), в течение 30 минут.
6. Слейте раствор DSP. Добавьте 10 мл 0,375 М трис(гидроксиметил)аминометана гидрохлорида (Tris-HCl), pH 8,8, содержащего 2% додецилсульфата натрия (SDS) для гашения непрореагировавшего DSP. Продолжайте нутацию в течение 15 минут.

4. SDS-СТРАНИЦА

1. Пока происходит закалка гелевой полоски, приготовьте растворы геля SDS-PAGE по стандартным методам. Не добавляйте реагенты для полимеризации.
2. После закалки верните гелевую полоску ΒΝ до комнатной температуры и отлите полоску в новую гелевую кассету.
   1. Для этого аккуратно поднимите гель и поместите его на чистую гелевую кассетную распорную пластину.
   2. Расположите полоску так, чтобы нижняя часть лицевой части красителя была ближе всего к верхней части новой кассеты (т.е. сторона, которая прошла дальше всего во время BN-PAGE, должна быть ближе всего к верхней части новой кассеты; гелевая полоска должна быть перевернута из своей предыдущей ориентации). Смотрите Рисунок 1.
   3. Расположите полоску так, чтобы ее верхний край лежал на одном уровне с тем местом, где будет верхний край накладки (т.е. он будет находиться в верхней части нового геля). Убедитесь, что лицевая сторона красителя параллельна горизонтальным краям стеклянной пластины.
   4. Прижмите одну сторону вырезанной полосы к одной из стенок распорки, оставив место с другой стороны для заливки геля и загрузки стандарта белка или лестницы.
   5. Если нижний край гелевой полоски содержит какие-либо неровные или неровные участки, аккуратно срежьте их. Если они присутствуют, они будут улавливать пузырьки во время заливки геля.
   6. После того, как гелевая полоска будет правильно размещена, наложите накладку на распорную пластину. Слегка надавите, чтобы вытолкнуть все захваченные пузырьки воздуха.
   7. Продолжайте собирать устройство для заливки геля в соответствии с инструкциями производителя.
3. Добавьте в растворяющий гелевый буфер реагенты для полимеризации, и залейте его в подготовленную гелевую кассету, используя серологическую пипетку. Заполните гелевую кассету на ~2 см ниже вырезанной гелевой полоски BN-PAGE, чтобы оставить место для слоя укладки.
4. Добавьте 100 мкл бутанола поверх залитого геля и дайте 30 минут для полимеризации растворяющего слоя. Слейте бутанол.
5. Добавьте реагенты для полимеризации в раствор укладывающего геля. С помощью серологической пипетки налейте слой укладки, чтобы заполнить все оставшееся пустое место в гелевой кассете.
   1. Наклоните гелевую кассету во время заливки слоя укладки, чтобы он заполнил пространство под полоской геля, и пузырьки воздуха не задерживались.
   2. По мере того как буфер для укладки геля заполняет пустое пространство под полоской геля, постепенно возвращайте кассету с гелем на ровное положение.
   3. Продолжайте заполнять пустое пространство рядом с вырезанной гелевой полоской с помощью укладывающегося гелевого буфера, пока он почти не переполнится.
6. Дайте слою штабелирования полимеризоваться в течение 30 мин.<бр/> заметка: Сделайте 10x SDS-PAGE беговой буфер (250 мМ трис(гидроксиметил)аминометана (трис), 1,9 М глицина, 1% SDS) во время полимеризации геля. Это также можно сделать заранее и хранить при комнатной температуре.
7. Разбавьте 50 мл 10x SDS-PAGE рабочего буфера до 450 мл dH₂O до 1x рабочего буфера.
8. После того, как слой укладки полимеризуется, извлеките гелевую кассету из разливочного аппарата, промойте dH₂O и соберите аппарат для электрофореза в соответствии с инструкциями производителя.
9. Полностью заполните внутреннюю камеру 1x SDS-PAGE рабочим буфером, затем заполните внешнюю камеру до уровня, указанного производителем.
10. Загрузите место рядом с иссеченной гелевой полоской с помощью лестницы молекулярных масс или соответствующего стандарта белка.
11. Подключите электроды к источнику питания и электрофорируйте образцы при напряжении 120 В. Когда краситель Кумасси стекает с геля, остановитесь и отключите источник питания.
12. Анализируйте гель с помощью стандартных методов электроблоттинга и обнаружения белка путем связывания антител.

Results

Рисунок 1: Общая многостраничная блок-схема.
(A) Получить лизат тканей с использованием методов, не вызывающих денатурацию, таких как гомогенизация в буфере для образцов BN-PAGE. (B) Лизат пипетки в гель BN-PAGE, затем электрофорез (150 вольт) в рабочем буфере BN-PAGE. Дайте образцу мигрировать, пока фронт красителя не мигрирует на ~2 см в разрешающий гель. (C) Уда...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
химикалии
ε-Аминокапроевая кислота	сигма	А2504
Акриламид	Акрос Органик	164855000	токсичный.
Акриламид/бисакриламид 37,5:1 (40% Т стоковый раствор)	БиоРад	161-0148 (Английский)	токсичный.
Персульфат аммония	сигма	А3678
Антикроличий IgG-HRP от козы	Санта Крус Биотехнологии	СК-2004
Набор для анализа бицинхониновой кислоты	Термофишер	No 23225
Бис-трис	сигма	В9754
Бычий сывороточный альбумин	сигма	А9647
бутанол	Научный центр Фишера	А399-1
Набор хемилюминесцентных подложек	ТермоФишер	No 24078
Кумасси синий G-250	Сигма-Олдрич	В0770
Дигитонин	сигма	Д141	токсичный.
Диметилсульфоксид	Научный центр Фишера	Д128-1
Дитиобис (сукцинимидилпропионат)	Термо Сайентиал	No 22585
Сухое обезжиренное молоко	ЛабораторияНаучный	М0841
глицерин	сигма	Г9012
глицин	Научный центр Фишера	БП381-5
Коктейль ингибиторов протеазы Halt	Термофишер	78430
соляная кислота	Научный центр Фишера	А144СИ-212	Для титрования. Едкий.
метанол	Научный центр Фишера	А412-4	Для активации мембраны PVDF. Токсичный.
Моноклональный анти-α-синуклеин IgG из кролика	Санта Крус Биотехнологии	sc-7011-R
N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин	сигма	Т9281
N,N'-метиленбисакриламид	Акрос Органик	16479	токсичный.
НП40	Бостон Биопродукты	-872
Полисорбат 20 (твин-20)	Научный центр Фишера	БП337-500
Мембраны для переноса поливинилиденфторида	Термо Сайентиал	88518
Понсо С	сигма	П3504
Хлористый калий	Научный центр Фишера	П217-3
Калийфосфат одноосновной	сигма	П9791
Коктейль ингибиторов протеазы	Термо Сайентиал	88265
Решение SDS (10% по объему)	БиоРад	161-0416
Хлорид натрия	Научный центр Фишера	БП358-212
Додецилсульфат натрия	сигма	Л37771
Натрия фосфат одноосновной	Научный центр Фишера	БП329-1
Трицин	сигма	Т0377
База Tris	Научный центр Фишера	БП152-500
Tris-HCl (0,5 М буфер, pH 6,8)	БиоРад	161-0799 (Английский)
Tris-HCl (буфер 1,5 М, pH 8,8)	БиоРад	161-0798
Инструменты
GE Imagequant LAS 4000	GE Healthcare	Тел.: 28-9558-10
Программное обеспечение ImageJ NIH
Считыватель микропланшетов Synergy H1	БиоТек
Формовщик геля + подставка	Биорад
Центрифуга Microfuge 22R	Бекман Коултер
Гомогенизатор 2 мл
Вихревой смеситель	Научный центр Фишера
Ультразвуковой гомогенизатор тканей	Научный центр Фишера	FB120220