Multimer-PAGE для разделения нативных белковых комплексов: гибридная методика разделения, состоящая из Blue Native-PAGE и SDS-PAGE для выделения интактных мультимерных белков из лизата тканей

Аннотация

Источник: Rhinesmith, T. et al., Multimer-PAGE: метод захвата и разрешения белковых комплексов в биологических образцах. J. Vis. Exp. (2017).

Это видео описывает мультимерную СТРАНИЦУ для отделения нативных белковых комплексов от тканевых гомогенатов. Техника представляет собой гибрид синих техник native-PAGE и SDS-PAGE. Разделенные комплексы могут быть охарактеризованы и изучены на предмет их роли в функционировании клеток.

Протокол

1. Подготовка тканей

1. Приготовьте 10 мл 4x BN-PAGE буфера для проб (200 мМ бис(2-гидроксиэтил)амино-трис(гидроксиметил)метана (Бис-трис), 200 мМ NaCl, 40% мас./об. глицерина, 0,004% Ponceau S, pH 7,2).
   заметка: Этот исходный раствор может быть изготовлен заранее и храниться при температуре 4 °C.
2. Разведите 250 мкл 4x буфера для образца в 750 мкл dH₂O, содержащем 1x коммерческий коктейль ингибиторов протеазы. Вихрь и охлаждение на льду.
3. Гомогенизируйте 20 мг ткани-мишени в 1 мл 1x ледяного буфера для образцов BN-PAGE с помощью 30 нажатий чистого гомогенизатора.
   заметка:

Результаты

Рисунок 1: Общая многостраничная блок-схема.
(A) Получить лизат тканей с использованием методов, не вызывающих денатурацию, таких как гомогенизация в буфере для образцов BN-PAGE. (B) Лизат пипетки в гель BN-PAGE, затем электрофорез (150 вольт) в рабочем буфере BN-PAGE. Дайте образцу мигрировать, пока фронт красителя не мигрирует на ~2 см в разрешающий гель. (C) Уда.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
химикалии
ε-Аминокапроевая кислота	сигма	А2504
Акриламид	Акрос Органик	164855000	токсичный.
Акриламид/бисакриламид 37,5:1 (40% Т стоковый раствор)	БиоРад	161-0148 (Английский)	токсичный.
Персульфат аммония	сигма	А3678
Антикроличий IgG-HRP от козы	Санта Крус Биотехнологии	СК-2004
Набор для анализа бицинхониновой кислоты	Термофишер	No 23225
Бис-трис	сигма	В9754
Бычий сывороточный альбумин	сигма	А9647
бутанол	Научный центр Фишера	А399-1
Набор хемилюминесцентных подложек	ТермоФишер	No 24078
Кумасси синий G-250	Сигма-Олдрич	В0770
Дигитонин	сигма	Д141	токсичный.
Диметилсульфоксид	Научный центр Фишера	Д128-1
Дитиобис (сукцинимидилпропионат)	Термо Сайентиал	No 22585
Сухое обезжиренное молоко	ЛабораторияНаучный	М0841
глицерин	сигма	Г9012
глицин	Научный центр Фишера	БП381-5
Коктейль ингибиторов протеазы Halt	Термофишер	78430
соляная кислота	Научный центр Фишера	А144СИ-212	Для титрования. Едкий.
метанол	Научный центр Фишера	А412-4	Для активации мембраны PVDF. Токсичный.
Моноклональный анти-α-синуклеин IgG из кролика	Санта Крус Биотехнологии	sc-7011-R
N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин	сигма	Т9281
N,N'-метиленбисакриламид	Акрос Органик	16479	токсичный.
НП40	Бостон Биопродукты	-872
Полисорбат 20 (твин-20)	Научный центр Фишера	БП337-500
Мембраны для переноса поливинилиденфторида	Термо Сайентиал	88518
Понсо С	сигма	П3504
Хлористый калий	Научный центр Фишера	П217-3
Калийфосфат одноосновной	сигма	П9791
Коктейль ингибиторов протеазы	Термо Сайентиал	88265
Решение SDS (10% по объему)	БиоРад	161-0416
Хлорид натрия	Научный центр Фишера	БП358-212
Додецилсульфат натрия	сигма	Л37771
Натрия фосфат одноосновной	Научный центр Фишера	БП329-1
Трицин	сигма	Т0377
База Tris	Научный центр Фишера	БП152-500
Tris-HCl (0,5 М буфер, pH 6,8)	БиоРад	161-0799 (Английский)
Tris-HCl (буфер 1,5 М, pH 8,8)	БиоРад	161-0798
Инструменты
GE Imagequant LAS 4000	GE Healthcare	Тел.: 28-9558-10
Программное обеспечение ImageJ NIH
Считыватель микропланшетов Synergy H1	БиоТек
Формовщик геля + подставка	Биорад
Центрифуга Microfuge 22R	Бекман Коултер
Гомогенизатор 2 мл
Вихревой смеситель	Научный центр Фишера
Ультразвуковой гомогенизатор тканей	Научный центр Фишера	FB120220