Электрофорез ампликонов ДНК в агарозном геле после ПЦР: метод анализа продуктов мультиплексной ПЦР и оценки успешности реакции ПЦР

Аннотация

Источник: Gulla, S. et al. Мультилокусный анализ тандемных повторов рыбопатогенной бактерии Yersinia ruckeri с помощью мультиплексной ПЦР и капиллярного электрофореза. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео мы демонстрируем разделение бактериальной ДНК, амплифицированной ПЦР, с помощью электрофореза в агарозном геле. Агарозный гель функционирует как молекулярное сито, позволяя отрицательно заряженной ДНК мигрировать в зависимости от ее размера под действием приложенного электрического поля.

Протокол

1. Подтверждение ампликона ПЦР методом гель-электрофореза

1. В соответствии с рекомендациями производителя приготовьте объем 1,5% (w/v) агарозного геля в 1x трис-борат-ЭДТА (TBE) буфере, соответствующем количеству тестируемых ПЦР-реакций. Перед отливкой добавьте 5 μL красителя флуоресцентных нуклеиновых кислот на 50 μL раствора геля и перемешайте. Используйте лотки и гребни по мере необходимости для литья, оставляя соответствующее количество лунок свободными для референсных лестниц ДНК.
2. После схватывания погрузите гель в 1x TBE-буфер в системе GE. Смешайте 5 μL продукта PCR с 2 μL загрузочного красителя и переложите в гелевые лунки. Добавьте 5 мкл лестницы ДНК в пустые лунки для справки.
3. Запустите гель при напряжении 110 В на 15 см в течение примерно 1 ч и используйте систему визуализации/визуализации геля на основе УФ-излучения для проверки наличия нескольких (до пяти) полос, представляющих ампликоны ПЦР (см. пример на рисунке 1). Выбросьте гель. Оставшуюся продукцию ПЦР хранить при температуре 4 °C до дальнейшей обработки.

Результаты

Рисунок 1: Гель-электрофорез, подтверждающий наличие нескольких продуктов ПЦР. Изображение подтверждает наличие нескольких ампликонов ПЦР во всех 12 дорожках, содержащих образцы, причем первая полоса представляет собой используемую лестницу ДНК. Были указаны размеры выбранных фрагментов лестницы, а также ПЦР-анализ и штаммовая принадлежность каждой дорожки.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Агароза, универсальная, peqGOLD	ВВР	732-2789П/732-2788
Буфер трис-борат-ЭДТА (КЭ)	NA	NA	Стандартный рецепт; производится на собственном производстве.
Гелевый краситель для загрузки ДНК (6X)	Thermo Fisher Scientific	Р0611
Система гелевого электрофореза	По желанию	NA
Краситель нуклеиновых кислот GelRed, 10 000X в воде	Биотиум	41003	Флуоресцентный краситель на нуклеиновых кислотах
GeneRuler 50.о. Лестница для ДНК, готовый к использованию	Thermo Fisher Scientific	СМ0373	Лестница ДНК
Система визуализации/визуализации геля на основе УФ-излучения	По желанию	NA