Капиллярный электрофорез: метод анализа флуоресцентно меченных ампликонов полимеразной цепной реакции

Аннотация

Источник: Gulla, S. et al., Мультилокусный анализ тандемных повторов рыбопатогенной бактерии Yersinia ruckeri с помощью мультиплексной ПЦР и капиллярного электрофореза. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео описывается техника капиллярного электрофореза для анализа флуоресцентно меченых ампликонов ПЦР, полученных из различных образцов в зависимости от их размера. Он генерирует миграционный паттерн, который определяет длину пар оснований фрагментов с помощью меченого флуоресцентного красителя в каждом фрагменте.

Протокол

1. Настройка и условия работы капиллярного электрофореза

1. После подтверждения ампликонов ПЦР разведите продукты ПЦР в соотношении 1:10 (v/v) в очищенной воде. Запечатайте, перемешайте и быстро центрифугируйте.
2. Работая в вытяжном шкафу, приготовьте объем мастер-смеси, состоящий из 9 μл формамида и 0,5 μл стандартного размера на одно изделие ПЦР (допустим 10% избыточного объема). Кратковременно распределите 9,5 мкл в лунки на планшете, подходящем для имеющейся системы КЭ, перед добавлением 0,5 мкл разбавленного ПЦР-продукта. Уплотните, перемешайте и быстро центрифугируйте.
   ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с осторожностью. При смешивании формамида с водой образуется муравьиная кислота, которая токсична.
3. С помощью термоамплификатора ПЦР денатурируйте образцы при температуре 95 °C в течение 3 минут, а затем охладите до 4 °C на неопределенный срок. Кратковременно центрифугируйте и загрузите планшет в откалиброванную систему CE в соответствии с инструкциями производителя.
4. Провести фрагментный анализ КЭ с использованием реагентов в соответствии с выбранным аппаратом и при следующих настройках: 60 °C; 5 с впрыскиваний при 1,6 кВ (32 В/см); 32 мин время работы при 15 кВ (300 В/см). Анализ фрагментов КЭ 24 лунок на 24-капилляре (50 см) обычно занимает около 50 минут.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Генетический анализатор Avant 3500xL	Thermo Fisher Scientific	А30469	Используется для анализа фрагментов капиллярного электрофореза.
Краситель нуклеиновых кислот GelRed, 10 000X в воде	Биотиум	41003	Флуоресцентный краситель нуклеиновой кислоты, используемый при гель-электрофорезе.
Программное обеспечение GeneMapper 5	Thermo Fisher Scientific	4475073	Используется для считывания электроферограмм с капиллярного электрофореза.
GeneScan 600 LIZ Размер красителя Стандарт v2.0	Thermo Fisher Scientific	4408399	Стандартный размер, используемый при капиллярном электрофорезе.
Хай-Ди Формамид	Thermo Fisher Scientific	4311320/4440753	Деионизированный формамид используется при капиллярном электрофорезе. Подготовьте рабочие аликауты.
Вода Milli-Q	NA	NA	Очищенная вода используется во время ПЦР и капиллярного электрофореза. Стандартный рецепт; Производится собственными силами.
Полимер POP-7 для генетических анализаторов 3500 Dx/3500xL Dx	Thermo Fisher Scientific	А26077/4393713/4393709	Разделительная матрица используется при капиллярном электрофорезе.
Система визуализации/визуализации геля на основе УФ-излучения	По желанию.	NA
Вортексер	По желанию.	NA