Щелочной гель-электрофорез: чувствительный метод количественной оценки повреждения ДНК в отдельных раковых клетках после химиотерапии

Аннотация

Источник: Lu, Y., et al. Оценка повреждений ДНК in vitro с помощью анализа комет J. vis. Exp. (2017)

В этом видео мы демонстрируем анализ щелочного электрофореза одиночных клеток для количественной оценки одно- и двухцепочечных разрывов ДНК в клетках, обработанных доксорубицином. Щелочные условия разрушают водородные связи между парами оснований ДНК, что приводит к полному раскручиванию и разделению нитей ДНК. Это позволяет осуществлять дифференциальную миграцию неповрежденных и поврежденных фрагментов ДНК в агарозном геле при электрофорезе, выявляя кометную структуру медленно мигрирующей неповрежденной ДНК, образующей круглую голову кометы, и быстро мигрирующие поврежденные фрагменты ДНК, образующие удлиненный хвост кометы.

Протокол

1. Подготовка реагентов

1. 1x PBS
   1. Разбавьте 100 мл 10x PBS с 900 мл dH₂O и отрегулируйте pH до 7,4 с помощью pH-метра. Хранить при комнатной температуре.
2. Лизисный раствор (ЛС)
   1. Приготовьте 2,5 М NaCl, 100 мМ динатрия ЭДТА, 10 мМ трис-основание и 200 мМ NaOH в 900 мл dH₂О; обычно требуется около 20 мин, чтобы смесь полностью растворилась. Отрегулируйте pH до 10 с помощью pH-метра. Добавьте 1% лаурилсаркозината натрия и 1% Triton X-100 и отрегулируйте окончательный объем до 1000 мл. Перед использованием охладите до 4°C не менее 30 минут.
3. Раствор щелочного электрофореза (AES), pH >13
   1. Приготовьте 200 мМ NaOH и 1 мМ динатрия ЭДТА в 800 мл dH₂O. Отрегулируйте pH и убедитесь, что он составляет pH >13. Отрегулируйте итоговый объем до 1 000 мл. Перед употреблением приготовьте свежий и охладите до 4°C в течение не менее 30 минут перед использованием
4. Раствор для окрашивания
   1. 1. Добавьте 1 мкл 10 000x зеленого флуоресцентного красителя нуклеиновой кислоты (например, SYBR Green) в 30 мл буфера Tris-EDTA (10 мМ Tris-HCl, 1 мМ динатрия EDTA, pH 7,4) и храните при температуре 4°C. Беречь от света.
5. 1% низкоплавкая агароза
   1. Расплавить 1% агарозу с низкой температурой плавления (1 г на 100 мл dH₂O) в микроволновой печи. Поворачивайте агарозу каждые 15-20 секунд, чтобы убедиться, что агароза полностью расплавилась. Перед использованием поместите агарозу на водяную баню при температуре 37°C не менее чем на 20 минут.
6. Предварительно подогрейте наконечники для пипеток
   1. Отрежьте узкие концы наконечников пипетки P200 на 3 мм и нагрейте до 37°C перед пипетированием агарозы.

2. Подготовка слайдов комет

1. Скользящее покрытие
   1. Растопите 1% агарозу (1 г на 100 мл dH₂O) в микроволновой печи в течение 2 - 3 минут или до полного расплавления агарозы. Опустите стеклянные предметные стекла микроскопа в агарозу и протрите одну сторону предметного стекла безворсовой салфеткой.
   2. Разложите предметные стекла на ровной поверхности для сушки на воздухе или нагрейте до 50°C для более быстрого высыхания; после высыхания должна образоваться прозрачная агарозная пленка. Перед использованием поместите предметные стекла с покрытием при температуре 37°C.
2. Приготовление суспензий одиночных клеток
   1. Культивирование и лечение клеток глиомы
      1. Культивировали клетки U251 MG в среде DMEM-Ham F-12 с добавлением 10% FBS, 100 Ед/мл пенициллина и 10 мкг/мл стрептомицина при 37°C с 5%_CO2.
      2. Расщепляют клетки с помощью 1 мл трипсина в течение 3 мин и нейтрализуют трипсин с помощью среды DMEM-Ham F-12 с FBS. Соберите в пробирку объемом 15 мл, вращайте при 300 x g в течение 4 минут, аспирируйте среду и суспензируйте клетки при давлении 2 x 10⁵ клеток/мл в 1x PBS.
         заметка: Образец клеток должен быть подготовлен непосредственно перед началом анализа, и все образцы должны обрабатываться в темной или затемненной среде, чтобы предотвратить повреждение ДНК светом.
      3. Смешайте суспензию ячеек с 1% расплавленной агарозой с низкой температурой плавления (при 37°C) в соотношении 1:10 (v/v), осторожно перемешайте пипеткой вверх и вниз и немедленно нанесите 30 μL на предметное стекло с агарозным покрытием. Используйте боковую сторону наконечника пипетки для распределения агарозно-клеточной смеси, чтобы обеспечить образование тонкого слоя.
      4. Поместите предметное стекло при температуре 4°C в темноте на 10 мин. Увеличение времени гелеобразования до 30 мин улучшает адгезирование образцов в условиях высокой влажности.
      5. Погрузите предметное стекло при температуре 4°C LS в темноту на 1 час или на ночь.
3. Электрофорез одиночных клеток
   1. Для анализа щелочных комет
      1. Аккуратно удалите предметные стекла из LS, слейте лишний буфер и осторожно погрузите в AES на 1 час при 4°C, чтобы ДНК раскрутилась. Держите горки в темноте.
      2. Добавьте предварительно охлажденный AES в лоток для предметных стекол для электрофореза, не превышайте 0,5 см над предметными стеклами (это зависит от размера блоков электрофореза), поместите стекла внутрь и накройте крышкой. Установите напряжение источника питания на 1 В/см (длина между электродами) и работайте в течение 30 минут при температуре 4°C.
      3. Слейте излишки раствора электрофореза со предметного стекла. Осторожно погрузите предметные стекла дважды в dH₂O на 5 минут каждый при комнатной температуре.
      4. Аккуратно погрузите предметные стекла в 70% этанол на 5 минут при комнатной температуре. Приступаем к окрашиванию.
4. Предметные стекла Stain Comet
   1. Сушите предметные стекла при температуре 37°C в течение 10 - 15 минут в темноте.
   2. Нанесите 50 - 100 μл зеленого флуоресцентного раствора для окрашивания нуклеиновых кислот на каждую высушенную агарозу и окрашивайте на 15 минут при комнатной температуре в темноте.
   3. Кратковременно промойте предметные стекла при dH₂O и полностью высушите при 37°C в темноте. Приступайте к получению и анализу изображений.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
10x PBS (Ca++, Mg++ бесплатно)	ТЕКнова	П0196
NaCl	сигма	С5886
Эдта	ТЕКнова	Е0308
База Тризма	сигма	Т1503
НаОХ	сигма	72068
Лаурилсаркозинат натрия	сигма	Л7414
Тритон Х-100	сигма	93443
SYBR Зеленый	Инвитроген	С33102
Низкая температура плавления агарозы	Инвитроген	16520
агароза	Инвитроген	16500
95% этанол	УОРНЕР-ГРЭМ	#64-17-5
трипсин	GIBCO	No 25300-054
Предметные стекла для стеклянных салфеток	НАУКИ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ	63422-11
Кимвайпс	Кимберли-Кларк
Микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл	ДЕНВИЛЛ
Наконечники для пипеток	острый
микроволновый	Аванти
Водяная баня	точность
Горизонтальная камера электрофореза	ТРЕВИГЕН	Кометассей ЭС II
электропитание	Био-Рад
инкубатор	Лаборатория Куинси	Модель 12-140E
Флуоресцентный микроскоп	Цейсс	ЛСМ700
Микропипетка	Эппендорф

шт.