Микрофлюидный капиллярный электрофорез для определения размера фрагментов продуктов ПЦР: метод электрофоретического разделения на основе микрочипов для разделения фрагментов ДНК в зависимости от размера

Аннотация

Источник: Wang, H., Zhu et al. Надежный полимеразный цепной анализ для количественного определения тринуклеотидных повторов цитозина-гуанина-гуанина в хрупком гене X с умственной отсталостью-1. J. Vis. Exp. (2019).

Это видео описывает технику микрофлюидного капиллярного электрофореза для разделения ампликонов ПЦР в зависимости от их размера. Этот метод помогает в определении размеров фрагментов с помощью флуоресцентных красителей и стандартных маркеров молекулярного размера.

Протокол

1. Определение размеров фрагментов ПЦР-продуктов

1. Перед началом работы дайте концентрату ДНК-красителя, гелевой матриксу ДНК, маркеру ДНК, лестнице ДНК и очищенным образцам ДНК уравновеситься до комнатной температуры в течение 30 минут.
2. Настройка станции заливки
   1. Замените шприц (см. Таблицу материалов) при использовании новой партии реагентов.
   2. Отрегулируйте опорную пластину, отпустите рычаг зажима шприца и сдвиньте его вверх в верхнее положение.
3. Запустите программное обеспечение для определения размеров (см. Таблицу материалов) и приготовьте смесь геля и красителя.
4. Концентрат вихревого красителя в течение 10 с и отжим вниз. Добавьте 25 мкл красителя в флакон с гелевой матрицей. Хорошо перемешайте перемешанный раствор и открутите вниз.
   1. Переложите смесь геля и красителя в отжимной фильтр. Поместите спиновой фильтр в микроцентрифугу и отжимайте в течение 10 минут при комнатной температуре 1 500 x g ± 20%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Защитите раствор красителем от света и храните при температуре 4 °C после использования. Смесь геля и красителя может быть использована примерно для 15 стружек после приготовления. Дайте смеси гелей и красителя сбалансироваться до комнатной температуры в течение 30 минут каждый раз перед использованием.
5. Загрузите смесь геля и красителя
   1. Вставьте новый чип ДНК в станцию прайминга. Добавьте 9 μл смеси гелей и красителя в лунку, отмеченную буквой «G». Убедитесь, что поршень расположен на отметке 1 мл, а затем закройте станцию заливки.
   2. Надавите на поршень шприца до тех пор, пока он не будет удерживаться зажимом. Подождите ровно 30 секунд, затем отпустите зажим. Подождите 5 с, а затем медленно потяните поршень обратно в положение 1 мл.
   3. Откройте станцию грунтовки и добавьте 9 μл гель-красящей смеси в лунки, отмеченные буквой «G».
6. Добавьте 5 μL маркера в лунку, отмеченную символом лестницы, а также добавьте 5 μL маркера в каждую из 12 лунок для пробы. Не оставляйте колодцев пустыми.
7. Добавьте 1 мкл ДНК-лестницы в лунку, отмеченную символом лестницы. Добавьте 1 л продукта ПЦР (использованные лунки) или 1 л сверхчистой воды (неиспользованные лунки) в каждую из 12 лунок для пробы. Поместите чип горизонтально в адаптер вихревого смесителя и вортекса на 1 минуту при указанной настройке (2 400 об/мин).
8. Вставьте чип в биоанализатор и запустите чип в приборе в течение 5 минут.
9. После того, как анализ будет завершен, немедленно извлеките использованный чип из инструмента.
10. Медленно добавьте 350 мкл деионизированной воды в одну из лунок электродного очистителя. Откройте крышку биоанализатора и поместите в нее очиститель электродов. Закройте крышкой и выдержите около 10 секунд. Откройте крышку и извлеките очиститель электродов. Подождите еще 10 секунд, чтобы вода на электродах испарилась, а затем закройте крышку.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Прибор для биоанализатора Agilent 2100: 0,2 мл ПЦР-пробирки	Аксиген	ПЦР-02D-C
Биоанализатор Agilent 2100: 1x TE буфер, pH 8,0, без рназы	Амбион	АМ9849
Прибор для биоанализатора Agilent 2100: Прибор для биоанализатора 2100	Agilent	G2939AA
Биоанализатор Agilent 2100: 96-луночный ПЦР-планшет	Термо Фишер	АВ0800
Прибор для биоанализатора Agilent 2100: картридж с электродами	Agilent		Комплектация оборудованием прибора «Биоанализатор 2100
Прибор для биоанализатора Agilent 2100: вихревой смеситель IKA	Agilent		Комплектация оборудованием прибора «Биоанализатор 2100
Прибор для биоанализатора Agilent 2100: Программное обеспечение для определения размеров 2100 Программное обеспечение Expert	Agilent		Комплектация оборудованием прибора «Биоанализатор 2100
Биоанализатор Agilent 2100: Тестовые чипы	Agilent		Комплектация оборудованием прибора «Биоанализатор 2100
Комплект Agilent DNA 7500	Agilent	5067-1506	Для определения размера фрагмента
Набор Agilent DNA 7500: DNA 7500 Ladder (желтый колпачок)	Agilent		В наборе: набор Agilent DNA 7500 (каталожный номер: 5067-1506)
Набор Agilent DNA 7500: Маркеры DNA 7500 (зеленый колпачок)	Agilent		В наборе: набор Agilent DNA 7500 (каталожный номер: 5067-1506)
Набор Agilent DNA 7500: ДНК-чипы	Agilent		В наборе: набор Agilent DNA 7500 (каталожный номер: 5067-1506)
Набор Agilent DNA 7500: концентрат красителя DNA (синяя крышка)	Agilent		В наборе: набор Agilent DNA 7500 (каталожный номер: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Флакон с гелевой матрицей ДНК (красный колпачок)	Agilent		В наборе: набор Agilent DNA 7500 (каталожный номер: 5067-1506)
Набор Agilent DNA 7500: Очиститель электродов	Agilent		В наборе: набор Agilent DNA 7500 (каталожный номер: 5067-1506)
Комплект Agilent DNA 7500: Спиновой фильтр	Agilent		Поставки набора Agilent DNA 7500 (каталожный номер: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Шприц	Agilent		Поставки набора Agilent DNA 7500 (каталожный номер: 5067-1506)
Станция грунтовки стружки	Agilent	5065-4401 (Английский)	Комплектация оборудованием прибора «Биоанализатор 2100
Вакуумный коллектор с фильтровальной пластиной: Вакуумный коллектор MultiScreenHTS	Мерк Миллипор	MSVMHTS00	Вакуумный прибор для фильтрующей пластины Вакуумный коллектор для очистки продуктов ПЦР
Вакуумный коллектор фильтровальной пластины: силиконовая пробка	Мерк Миллипор	XX2004718	Вакуумный коллектор с фильтровальной пластиной
Вакуумный коллектор с фильтровальной пластиной: Вакуумный насос	Мерк Миллипор	WP6122050	Вакуумный коллектор с фильтровальной пластиной
Вакуумный коллектор с фильтровальной пластиной: Емкость для сбора отходов	Мерк Миллипор	XX1004705	Вакуумный коллектор с фильтровальной пластиной

» » » » гг. »