$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Блокирование свободных остатков цистеина с помощью йодоацетамида
- Выращивайте клетки U-2 OS в чашке размером 6см2 до 50–60% конфлюенции в минимально незаменимой среде с высоким содержанием глюкозы, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пирувата натрия при 37 °C в 5%CO2.
- Сделайте свежий запас 10 мМ йодоацетамида непосредственно перед использованием, затем выбросьте любой неиспользованный реагент.
- Добавляйте 0,1 мМ йодоацетамида в конечной концентрации непосредственно в среду для культивирования клеток. Аккуратно покачиваем блюдо при комнатной температуре в течение 2 минут.
2. Сбор клеток
- Отсасывайте среду из клеток.
- Промойте клетки 5 мл холодного фосфатно-солевого буфера (PBS) три раза. Отсадите окончательный раствор для промывки PBS, затем добавьте 1 мл холодного PBS.
- Соскребите ячейки со дна посуды с помощью скребка для клеток. С помощью пипетки объемом 1 мл наберите PBS и клеточную суспензию и распределите всю жидкость в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
- Вращайте клетки при температуре 7500 x g в течение трех минут при 4 °C. Аспирируйте PBS, оставляя клеточную гранулу. Гранулы ячеек могут храниться при температуре -80 °C до обработки
3. Экстракция белка
- Приготовьте 100 мкл буфера для лизиса 1x, разведенного в ddH2O (см. таблицу материалов). Добавьте фенилметилсульфонилфторид (PMSF) непосредственно перед применением до конечной концентрации 1 мМ.
- Добавьте 50 мкл буфера для лизиса 1x непосредственно в клеточную гранулу и суспензируйте. Инкубируйте его на льду в течение 5 минут.
- Обрабатывайте ультразвуком в течение 8 с, используя постоянный импульсный режим при 40% (см. Таблицу материалов для ультразвукового аппарата; при необходимости корректируйте для разных ультразвуковых аппаратов), удерживая экстракт на льду.
- Отжим экстракт при температуре 4 °C в течение 5 минут при 16 000 x g. Надосадочная жидкость представляет собой растворимую белковую фракцию. При желании может быть выполнен анализ Брэдфорда для определения концентрации белка.
4. Подготовка образцов
- Возьмите 10 μЛ растворимого белкового экстракта и добавьте 10 μЛ 1x Laemmli SDS-образца (4% SDS, 20% глицерина, 0,004% бромфенолового синего и 0,125 М Tris-HCl, pH 6,8). Не добавляйте восстановительные реагенты.
- Храните образцы на льду, если в этот день будет проводиться анализ SDS PAGE; для длительного хранения подходит -20 °C. Непосредственно перед запуском геля нагрейте образец в течение 5 минут до 85 °C.
5. Перекрестное сшивание формальдегида in vivo эндогенных белков в клетках U-2 OS
- Выращивайте клетки U-2 OS в колбе 175 см2 до 70–80% конфлюенции.
- Провести реакцию сшивания формальдегида
- В вытяжном шкафу аликвотируется 37% раствор формальдегида, приобретенный из коммерческих источников. Добавьте фиксатор формальдегида непосредственно в среду до конечной концентрации 1% и инкубируйте при комнатной температуре при осторожном перемешивании в течение 15 минут.
- Чтобы погасить реакцию, добавьте 1,25 М глицина до конечной концентрации 0,125 М и инкубируйте при комнатной температуре с легким перемешиванием на коромысле в течение 5 минут.
- Промойте клетки 5 мл холодного PBS три раза. Отсадите окончательный раствор для промывки PBS и добавьте 10 мл PBS. Соскребите ячейки со дна колбы с помощью скребка для ячеек.
- С помощью пипетки объемом 10 мл наберите PBS и клеточную суспензию и распределите всю жидкость в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл. Вращайте клетки при давлении 500 x g в течение 2 минут при 4 °C. Аспирируйте PBS, оставляя клеточную гранулу.
6. Фракционирование ядер
- Приготовьте 10 мл гомогенизационного буфера: 0,25 М сахарозы, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ HEPES и 0,5% BSA при pH 7,4. Добавьте PMSF непосредственно перед применением в конечную концентрацию 1 мМ и 3 мл буфера для суспензии ядер (0,1% Triton X-100 в PBS).
- Добавьте 5 мл гомогенизационного буфера непосредственно в клеточную гранулу и полностью суспензируйте. Центрифугируйте суспензию при давлении 500 x g в течение 2 мин при 4 °C, затем выбросьте надосадочную жидкость.
- Суспензируйте гранулу в 5 мл гомогенизационного буфера. Используйте плотно прилегающий гомогенизатор из стеклотефлона, гомогенизируйте клетки со скоростью 10 ходов/500 об/мин.
- Центрифугируйте суспензию при давлении 1 500 x g в течение 10 мин при 4 °C, затем выбросьте надосадочную жидкость><.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте надосадочную жидкость для выделения митохондрий путем центрифугирования при 10 000 x g в течение 10 минут.
- Суспендировать гранулу в суспензионном буфере по 1 мл ядер и инкубировать на льду в течение 10 мин.
- Центрифугируйте при 600 х г в течение 10 мин. Выбросьте надосадочную жидкость.
- Суспензию гранулы в 1 мл суспензионного буфера для ядер и снова центрифугировать. Выбросьте надосадочную жидкость. Конечная гранула будет представлять собой изолированные ядра.
7. Экстракция белка
- Повторите раздел 4, за исключением добавления 25 мкл буфера для лизиса 1x непосредственно в клеточную гранулу с последующим суспендированием.
8. Подготовка образцов
- Подготовьте два образца для SDS-PAGE, взяв по 10 мкл растворимого белкового экстракта и добавив 10 мкл 2x Laemmli SDS-sample буфера и 1 мкл 2-меркаптоэтанола (BME).
- Нагрейте один образец в течение 5 минут при 37 °C, а второй образец в течение 15 минут при 98 °C для обратного поперечного сшивания формальдегида.
9. Анализ SDS-PAGE
- Приготовьте 1 л 1x Трис-глицина бегового буфера (25 мМ Трис, 192 мМ глицина, 0,1% (мас./об.) SDS).
- Настройте рабочее устройство SDS-PAGE.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используется 16% сборный TGX SDS-Page. Следует отметить, что процентный сбор геля может быть использован в любом процентном соотношении.
- В соответствии с протоколом производителя откройте упаковку, в которой хранится гель, и извлеките кассету.
- Снимите гребень, которым выстилаются лунки, и ленту со дна кассеты.
- Поместите гель в беговой аппарат.
- Заполните камеру 1x работающим буфером до тех пор, пока лунки не будут погружены в жидкость. С помощью пластиковой пипетки промойте лунки с работающим буфером.
- Загрузите образцы в гель вместе с предварительно окрашенным стандартным маркером объемом 10 мкл.
- Прогоняйте гель при напряжении 200 В, пока фронт красителя не окажется примерно в 1 см от дна геля.