Жидкофазная изоэлектрическая фокусировка: метод электрофореза для выделения биологически активных молекул из сырого экстракта Gymnema sylvestre

Аннотация

Источник: Veerapandian, R., et al. Разделение биоактивных малых молекул, пептидов из природных источников и белков из микробов методом препаративной изоэлектрической фокусировки (IEF). J. Vis. Exp. (2020).

В этом видео описывается метод отделения сложных молекул от растительных экстрактов с помощью изоэлектрической фокусировки в жидкой фазе. Этот метод помогает очищать сложные биомолекулы в их естественном состоянии, которые могут быть использованы для различных последующих применений.

Протокол

1. Разделение и очистка малых молекул и пептидов из экстракта Gymnema sylvestre

1. Отмерьте 0,6 г растительного экстракта и растворите в дистиллированной воде (60 мл), перемешав в роликовой трубке в течение 5 мин.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Любой биологический образец, который является растворимым и не содержит соли, может быть использован для разделения и очистки с помощью прибора для жидкофазной изоэлектрической фокусировки (IEF). Образцы с буферной концентрацией соли до 10 мМ могут быть использованы с несколько уменьшенным разрешением.
2. Центрифугируйте растворенный растительный экстракт при давлении 10 000 x g в течение 5 минут для удаления нерастворимых частиц.
3. Перенесите надосадочную жидкость (~60 мл) в центрифужную пробирку объемом 80 мл и смешайте его с 0,6 мл амфолита (pH 3-10) до 1% (v/v).
4. Подготовьте блок жидкофазного ВЭФ.
   1. Соберите жидкофазные электроды IEF (анод-красная кнопка и катодно-черная кнопка) с соответствующими обменными мембранами в соответствии с инструкцией по эксплуатации (Таблица материалов). При использовании новых мембран уравновешивайте анионообменные мембраны 0,1 М NaOH и катионообменные мембраны 0,1 М_Н3ПО4 не менее чем в течение 16 ч.
   2. Храните мембраны в электролитах (0,1 М NaOH или 0,1 М Н₃ПО₄) между прогонами и не допускайте высыхания.
   3. Соберите внутреннюю и внешнюю часть электрода, совместив три продолговатых отверстия в ионообменных прокладках. Заполните электроды соответствующими электролитами (~25-30 мл), чтобы предотвратить высыхание их мембран.
   4. Не добавляйте избыток (более 1/3 объема электродной камеры) электролита, который может создать давление внутри электрода и вызвать утечку.
   5. Закройте отверстия для сбора проб уплотнительной лентой, которая идет в комплекте с деталями прибора (Таблица материалов). Сторону отверстий для сбора проб можно определить по двум вертикальным металлическим выравнивающим штифтам. В качестве альтернативы используйте стандартную уплотнительную ленту для герметизации портов.
   6. Соберите последовательно все детали фокусирующей камеры в сборе (анодный электрод, сердечник нейлоновой мембраны, фокусировочная камера и катодный электрод) над керамическим охлаждающим пальцем.
   7. Заполните фокусировочную камеру предварительно охлажденной дистиллированной водой (общий объем 60 мл для стандартной ячейки IEF) с помощью шприца объемом 50 мл.
   8. Подключите жидкофазный прибор IEF к циркуляционной охлаждающей воде при температуре 4 ºC и запустите устройство на 15 Вт и 3 000 В в течение 3-5 минут или до стабилизации напряжения><. ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, в течение одной минуты напряжение достигает максимальных установленных значений. Предварительный прогон дистиллированной водой помогает удалить остаточные ионы из фокусирующей камеры и сердцевины нейлоновой мембраны.
   9. Выключите источник питания и удалите воду из ячейки с помощью сборщика фракций. Повторно заклейте сборные отверстия уплотнительной лентой. Теперь камера готова к загрузке образца.
5. Используйте шприц объемом 50 мл с иглой 1-1/2 дюйма с тупым концом 19 G (входит в комплект поставки) и загрузите подготовленный образец с амфоллитом (всего 60 мл) в ячейку через отверстия для сбора образцов.
6. Удалите пузырьки воздуха из ячейки для образца, сняв фокусирующую ячейку со стойки и постучав по электродной камере, чтобы выбить пузырьки. Наличие пузырьков воздуха вызовет колебания напряжения и тока и повлияет на ход.
7. Подключите установку к водяной охлаждающей жидкости (4 °C) и начните фракционирование с источником питания при постоянной мощности 15 Вт.
8. Запустите аппарат в течение 3 часов или до тех пор, пока напряжение не достигнет постоянного значения><. ПРИМЕЧАНИЕ: Когда образец начнет фокусироваться, напряжение начнет постепенно расти, пока не достигнет постоянного значения.
9. После прогона подготовьтесь к сбору фракций в ящике для сбора урожая (содержащем 20 пластиковых трубок, 12 мм x 75 мм, объемом 5-6 мл), подключенном к вакуумному насосу, путем нажатия кнопки сбора ON в блоке IEF.
10. Совместите контакты 20-го сбора с 20-собирательными портами фокусировочной ячейки, которая запечатана лентой.
11. Проденьте сборные штифты через уплотнительную ленту и одновременно включите вакуумный насос (рис. 1B, 1C и 1D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Около 3 мл фракций из каждой камеры будут собираться в пробирки за каждый раз. Фракции могут быть использованы для последующих применений (SDS-PAGE для количественного определения пептидов, TLC и биотестирования для малых молекул).

Результаты

Рисунок 1:Установка жидкофазного аппарата ИЭФ и фракционирование растительного экстракта G. sylvestre. (А) во время прогона, (В) во время сбора фракции, (В) после сбора фракции и (Г) части аппарата жидкофазного ИЭФ, 1) ионообменные мембраны, 2) фокусирующая камера и сердцевина мембраны, 3) электродная сборка (отрицательная), 4) электродная сборка (положительная).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Шприцевой фильтр 0,45 мкм	Научный Фишер	Тел.: 09-720-004
Био-Лит 3/10 Амфолит	Био-Рад	163-1113
Био-Лит 5/8 Амфолит	Био-Рад	163-1192
Компактный низкотемпературный термостат	Лауда-Бринкманн	RM 6T	Установите водяное охлаждение на 4°C, и он может работать даже при 0°C, так как при прохождении через охлаждающее ядро Rotofor температура циркулирующей воды будет около 5 или более в зависимости от напряжения.
Порошок экстракта листьев растения Gymnema (>25% гимнемовых кислот)	Суан Фарма, Нью-Джерси, США
Мини протейный электрофорез	Био-Рад
pH-метр	Mettler Toledo	С20	Полезно для определения рН фракций Rotofor (жидкофазный IEF)
Ротофор	Био-Рад	170-2972	http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Инструкция по сборке агрегата)
RPMI-1640 Средний	ГиКлон	DH30255.01
Уплотнительная лента	Био-Рад	170-2960	Также можно использовать скотч
Центрифуга Sorvall legend micro 17	Термонаучная	75002432

гг. гг.