Методическая статья

Аффинный капиллярный электрофорез со сдвигом подвижности: метод анализа взаимодействий выборка-лиганд в зависимости от дифференциальной миграции комплексов белок-лиганд

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Nachbar M. et al., Анализ внутреннего беспорядка AtHIRD11 и связывания с ионами металлов с помощью электрофореза капиллярного геля и аффинного капиллярного электрофореза. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео описывает метод анализа взаимодействия белка и лиганда с помощью капиллярного электрофореза со сдвигом подвижности. Этот метод может быть использован для характеристики связывания белка с различными заряженными лигандами.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовьте решения для анализа ACE

  1. Приготовьте 1 М раствор NaOH.
    1. Свесьте 4,0 г NaOH в мерной колбе объемом 100 мл.
    2. Заполните его до отметки деионизированной водой, чтобы получился запас размером 1 М.
  2. Приготовьте 0,1 М этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) в 0,1 М растворе NaOH.
    1. Переведите 10 мл 0,1 М NaOH в мерную колбу объемом 100 мл с помощью пипетки с лампочкой объемом 10 мл. Заполните его до отметки деионизированной водой.
    2. Взвесьте 2,42 г ЭДТА на весовом судне и растворите твердое вещество в 100 мл 0,1 М NaOH.
  3. Приготовьте раствор Трис-буфера (30 мМ).
    1. Добавьте 3,63 г триса, 200 мл деионизированной воды и перемешайте батончик в стакан объемом 500 мл. Поместите стакан на пластину для перемешивания и включите его.
    2. Поместите в стакан электрод для измерения pH и отрегулируйте pH до 7,4 с помощью 0,1 М HCl.
    3. Налейте раствор в мерную колбу объемом 1 л и заполните до отметки деионизированной водой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эту процедуру необходимо повторить, иначе потребуется большая мерная колба, так как для всего анализа требуется более 1 л.
  4. Приготовьте раствор ацетанилида электроосмотического проточного (EOF)-маркера (60 мкМ).
    1. Добавьте 6 мг ацетанилида и 100 мл трис-буфера в мерную колбу объемом 100 мл.
    2. Поставьте мерную колбу в ультразвуковую ванну и включите ее на 30 минут.
  5. Приготовьте образец (1 мг/мл) раствора.
    1. Поставьте микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 мл на прецизионные весы и добавьте в пробирку 0,3 мг лиофилизированного порошка AtHIRD11.
    2. С помощью микропипетки добавьте в пробирку 0,3 мл 30 мМ Трис-буфера (pH 7,4). Осторожно встряхните тюбик, чтобы белок растворился.
  6. Приготовьте растворы лигандов.
    1. Приготовьте стоковый раствор CaCl2 (5 мМ).
      1. Возьмите лодку для взвешивания, поставьте ее на аналитические весы и взвесьте 36,76 мг CaCl2*H2O.
      2. С помощью микропипетки смойте CaCl2*H2O из весовой лодочки в мерную колбу объемом 50 мл с заранее подготовленным буфером Tris.
      3. Заполните мерную колбу буфером Трис до отметки.
    2. Приготовьте оставшиеся стоковые растворы (5 мМ).
      1. Повторите шаг 1.6.1, используя другие соли металлов вместо CaCl2*H2O [MgCl2: 23,80 мг, BaCl2: 26,02 мг, Sr(NO3)2: 52,91 мг, MnCl2: 31,46 мг, SeCl4: 52,91 мг, CoCl2*2H2O: 41,47 мг, CuCl2*2H2O: 42,62 мг, ZnCl2: 3,41 мг и NiCl2*6H2O: 59,43 мг].
        заметка: Раствор ZnCl2 имеет концентрацию 0,5 мМ. Поскольку наблюдалось сильное взаимодействие между ионами и внутренней стенкой капилляра, концентрация была снижена в 104 раза.
    3. Приготовьте 500 мкМ раствор CaCl2.
      1. Залейте 10 мл стокового раствора CaCl2 и положите его в мерную колбу объемом 100 мл.
      2. Заполните мерную колбу с буфером Трис до отметки и встряхните колбу.
    4. Приготовьте 250 мкМ раствор CaCl2.
      1. Залейте 5 мл стокового раствора CaCl2 и налейте его в мерную колбу объемом 100 мл.
      2. Заполните мерную колбу с буфером Трис до отметки и встряхните колбу.
    5. Повторите предыдущие шаги для других исходных решений.
  7. Наполните растворы во флаконы.
    заметка: Для каждого повторного прогона требуется набор входных и выходных флаконов. Использование свежих растворов лигандов на входе и выходе сокращает время миграции после каждого прогона.
    1. Залейте 250 мкМ раствор CaCl2 в шприц объемом 10 мл.
    2. Наденьте на шприц фильтр PVDF толщиной 0,22 мкм и протолкните 2 мл раствора через фильтр с помощью шприца, чтобы сбросить этот отфильтрованный раствор.
    3. Наполните 10 флаконов до максимально допустимого объема оставшимся 250 μМ раствором CaCl2 шприца. Отметьте каждый как 250 мкМ раствор CaCl2 во входном флаконе.
    4. Наполните 10 флаконов до полного заполнения раствором CaCl250 μM. Обозначьте каждый как выходной флакон с раствором CaCl2 250 мкМ.
    5. Повторите шаги 1.7.1 - 1.7.4 для других растворов металлов, содержащих соль.
    6. Повторите эти действия для каждой пары входных и выходных флаконов, используя вместо этого раствор 30 мМ Tris (pH 7,4).
      заметка: Трис-буфер 30 ммоль/л pH 7,4 используется между прогонами для получения данных о времени миграции белка в отсутствие ионов металлов. Необходимо пренебречь изменениями в EOF.
    7. Повторите описанные выше действия для одного флакона, используя вместо этого раствор ацетанилидного EOF-маркера (60 мкМ). Кроме того, повторите эти шаги, используя вместо этого образец раствора (1 мг/мл).

2. Аффинный капиллярный электрофоретический анализ

  1. Кондиционирование капилляра
    1. Установите термостат на 23 °C.
      заметка: Температура используется в соответствии с опубликованными протоколами и может быть изменена на другие температуры. Однако взаимодействия зависят от температуры и будут меняться соответственно.
    2. Промывайте капилляр в течение 40 минут при давлении 2,5 бар с 0,1 М NaOH.
    3. Промойте капилляр в течение 10 минут при давлении 1,0 бар деионизированной водой.
    4. Промойте капилляр в течение 30 минут при давлении 1,0 бар с помощью 30 мМ Трис-буфера (pH 7,4).
  2. Подготовка к методам АПФ
    1. Подготовьте метод для измерений без лигандов.
      заметка: Ацетанилид в раствор образца не добавляли, так как он маскирует 2 белковых пика.
      1. Промойте капилляр в течение 1 минуты при давлении 2,5 бар 0,1 М раствором ЭДТА.
      2. Промойте капилляр в течение 1 минуты при давлении 2,5 бар деионизированной водой.
      3. Промойте капилляр в течение 1,5 минуты при давлении 2,5 бар с помощью буфера Tris для балансировки.
      4. Введите раствор ацетанилида в течение 6 с с давлением 0,05 бар и замените входной и выходной флаконы на буферные флаконы Tris.
      5. Нанесите 0,05 бар на 2,4 с для того, чтобы протолкнуть раствор ацетанилида с кончика капилляра дальше внутрь.
      6. Подайте напряжение 10,0 кВ на 6 мин и определите пик ацетанилида на длине волны 200 нм.
      7. Повторите шаги 2.2.1.1. - 2.2.1.6. с использованием образца белка вместо раствора ацетанилида и определите все пики белка.
    2. Подготовьте метод для измерений с помощью лигандов.
      1. Промойте капилляр в течение 1 минуты при давлении 2,5 бар 0,1 М раствором ЭДТА.
      2. Промойте капилляр в течение 1 минуты при давлении 2,5 бар деионизированной водой.
      3. Промойте капилляр в течение 1,5 мин при давлении 2,5 бар раствором лиганда для уравновешивания.
      4. Введите раствор ацетанилида в течение 6 с с давлением 0,05 бар и замените входной и выходной флаконы на лиганд-содержащие буферные флаконы.
      5. Нанесите 0,05 бар на 2,4 с для того, чтобы протолкнуть раствор ацетанилида с кончика капилляра дальше внутрь.
      6. Подайте напряжение 10,0 кВ на 6 мин и определите пик ацетанилида на длине волны 200 нм.
      7. Повторите шаги 2.2.2.1 - 2.2.2.6 с использованием образца белка вместо раствора ацетанилида и определите все пики белка.
    3. Поочередно повторяйте шаги 2.2.1 и 2.2.2 для того, чтобы рассчитать изменение соотношения заряд-размер для различных взаимодействий белков-металлических ионов.
      1. Меняйте белковый раствор через каждые 60 ч на свежий.
        заметка: На этом этапе эксперимент можно приостановить. Эту процедуру повторяют, по крайней мере, 10 раз для каждой концентрации лигандов, поскольку пиковая картина незначительно меняется от прогона к прогону. Если раствор используется дольше 60 часов, вариации становятся слишком большими.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Образец AtHIRD11 Университет Сидзуока (группа проф. М. Хара) Дегидриновый белок из Arabidopsis thaliana экспрессируется в кишечной палочке
Баотказ от диоксида кремния капиллярный, Polymicro Technologies (Финикс, США) 106815-0017 TSP050375 внутренний диаметр 50 мкм, внешний диаметр 363 мкм, полиимидное покрытие
Agilent 1600A Agilent Technologies (Вальдбронн, Германия)Инструмент для капиллярного электрофореза; Вместо этого можно использовать Agilent 7100 CE
Пипетка с лампой 25 мл Duran Group GmbH (Майнц, Германия)24 338 14Приготовление раствора лиганда
Duran glas мерная колба 25 мл Duran Group GmbH (Майнц, Германия) 24 671 1457Приготовление исходного раствора лиганда
Duran glas мерная колба 10 мл Duran Group GmbH (Майнц, Германия) 24 671 1054Приготовление исходного раствора лиганда
Ацетанилид Sigma-Aldrich (Штайнхайм, Германия) 397229-5ГЭлектроосмотический маркер течения
Хлорид марганца(II) Sigma-Aldrich (Штайнхайм, Германия) 13217лиганд
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) Sigma-Aldrich (Штайнхайм, Германия)431788-100ГИнгредиент для полоскания
Хлорид бария Sigma-Aldrich (Штайнхайм, Германия)202738-5Глиганд
Гексагидрат хлорида никеля(II) Sigma-Aldrich (Штайнхайм, Германия) 654507-5Глиганд
Хлорид селена (IV) Sigma-Aldrich (Штайнхайм, Германия)323527-10Глиганд
2-амино-2-гидроксиметилпропан-1,3-диол (Трис) Sigma-Aldrich (Штайнхайм, Германия)252859-100ГБуферный ингредиент
Хлорид цинка(II) Merck Millipore (Дармштадт, Германия)1088160250лиганд
Нитрат стронция Merck Millipore (Дармштадт, Германия)1078720250лиганд
Дигидрат хлорида кальция Merck Millipore (Дармштадт, Германия) 1371015000лиганд
Дигидрат хлорида меди(II) Riedel-de Haën (Seelze, Германия)No 31286лиганд
Agilent ChemStation Rev. 8.04.03- SP1 Agilent Technologies (Вальдбронн, Германия)Г2070-91126Программные комплексы для работы с приборами КЭ, получения данных и их оценки

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Affinity Capillary ElectrophoresisProtein Ligand InteractionMobility Shift AnalysisCapillary Electrophoresis MethodProtein Metal Ion ComplexElectro Osmotic FlowLigand Binding CharacterizationCharge Size RatioElectrophoretic Mobility MeasurementEDTA Capillary Rinse

Похожие статьи