Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле: метод разделения для анализа белков в сложной белковой смеси на основе заряда и молекулярной массы

Аннотация

Источник: Zhan, X., et al. Двумерный гель-электрофорез в сочетании с методами масс-спектрометрии для анализа протеома ткани аденомы гипофиза человека J. vis. Exp. (2018)

В этом видео мы демонстрируем метод двумерного гель-электрофореза, который отделяет отдельные белки от сложной белковой смеси, полученной из опухолевых тканей нефункциональной гипофизарной аденомы человека (NFPA). Белки разделяются на основе их электрического заряда в первом измерении и далее разделяются на основе молекулярных масс во втором измерении.

Протокол

1. Подготовка образцов

1. Соберите ткани аденомы гипофиза (0,2 - 0,5 мг) из нейрохирургического отделения. Сразу заморозьте в жидком азоте, а затем перенесите на хранение до -80 °С.
2. Добавьте 2 мл 0,9% NaCl в деионизированную дистиллированную воду (ddH₂O). Используйте этот раствор для легкого смывания крови с поверхности ткани (3x).
   NOTE: ddH₂O с проводимостью 18,2 МОм/см используется во всем протоколе. Часть ткани может быть потеряна при смывании крови с поверхности ткани.
3. Добавьте объем (10 мл; 4 °С) раствора, содержащего 2 М уксусную кислоту и 0,1% (v/v) β-ме....

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Ettan IPGphor 3	GE Healthcare		Изоэлектрическая система фокусировки.
Система Ettan DALT II	Amersham Pharmacia Biotech, Пискатауэй, Нью-Джерси, США		Система вертикального электрофореза
Держатель полосы Ettan IPGphor	Amersham Pharmacia Biotech, Пискатауэй, Нью-Джерси, США
Мультигелевый кастер Ettan DALTsix	Amersham Pharmacia Biotech, Пискатауэй, Нью-Джерси, США		Мультигелевый кастер
КимВайп	Кимвайп		Нерастворимое бумажное полотенце
Вода	Сделано с помощью инструмента PURELAB flex
Гомогенизатор Polytron Model P710/35	Brinkmann Instruments, Вестбери, Нью-Йорк
Набор для анализа белка BCA от Pierce	Thermo Fisher Scientific	No 23227
Набор 2-D Quant	GE Healthcare	80-6483-56
БИС-АКРИЛАМИД	АМРЕСКО	0172
АКРИЛАМИД	АМРЕСКО	0341
ДТТ	Сигма-Олдрич	Д0632
Тиореа	Сигма-Олдрич	Т8656
мочевина	ВЕТЭК	V900119
Паспорт безопасности	АМРЕСКО	0227
Ребята	АМРЕСКО	0465
ТЕМЕД	АМРЕСКО	М146
Персульфат аммония	АМРЕСКО	М133
Буфер IPG pH 3-10, NL	GE Healthcare	17-6000-87
Immobiline Dry Strip pH 3-10NL, 18см	GE Healthcare	Тел.: 17-1235-01