Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле: метод разделения для анализа белков в сложной белковой смеси на основе заряда и молекулярной массы

Аннотация

Источник: Zhan, X., et al. Двумерный гель-электрофорез в сочетании с методами масс-спектрометрии для анализа протеома ткани аденомы гипофиза человека J. vis. Exp. (2018)

В этом видео мы демонстрируем метод двумерного гель-электрофореза, который отделяет отдельные белки от сложной белковой смеси, полученной из опухолевых тканей нефункциональной гипофизарной аденомы человека (NFPA). Белки разделяются на основе их электрического заряда в первом измерении и далее разделяются на основе молекулярных масс во втором измерении.

Протокол

1. Подготовка образцов

1. Соберите ткани аденомы гипофиза (0,2 - 0,5 мг) из нейрохирургического отделения. Сразу заморозьте в жидком азоте, а затем перенесите на хранение до -80 °С.
2. Добавьте 2 мл 0,9% NaCl в деионизированную дистиллированную воду (ddH₂O). Используйте этот раствор для легкого смывания крови с поверхности ткани (3x).
   NOTE: ddH₂O с проводимостью 18,2 МОм/см используется во всем протоколе. Часть ткани может быть потеряна при смывании крови с поверхности ткани.
3. Добавьте объем (10 мл; 4 °С) раствора, содержащего 2 М уксусную кислоту и 0,1% (v/v) β-меркаптоэтанола, на каждые 0,5 - 0,6 г ткани, гомогенизируйте (1 мин, 13 000 об/мин, 4 °С, 10x) с помощью тканевого гомогенизатора, ультразвуком обрабатывайте в течение 20 с, лиофилизируйте и храните при -80 °С.
4. Измерьте содержание белка в лиофилизированных, гомогенизированных образцах с помощью набора для анализа бицинхониновой кислоты (БЦА)
   заметка: Количественная оценка BCA не является абсолютной количественной оценкой, и измеренный результат будет изменен при использовании другого техника и экспериментального агента. Для различных экспериментов следует использовать фиксированный стандарт образца концентрации. Таким образом, окончательное количество белков для каждого 2D-геля будет определено с помощью изображения, окрашенного серебром или Кумасси, с хорошим разрешением в предварительно запланированных экспериментах.
   1. Добавить около 300 мкг лиофилизированного гомогенизированного образца в один объем (282 мкл) буфера для экстрагирования белка (8 М мочевины и 4% CHAPS), затем выдержать в течение 2 ч, обработать ультразвуком на водяной бане в течение 5 мин, вращать в течение 1 ч, снова обработать ультразвуком на водяной бане в течение 5 мин, снова повернуть в течение 1 ч. и центрифугирование при 15 000 x g в течение 20 мин.
   2. Приготовьте стандартные растворы БСА с указанными концентрациями: 0, 25, 125, 250, 500, 750, 1 500, 2 000 мкг/мл с коммерческим стандартом БСА (2 мг/мл).
   3. Перед применением смешайте реагент ВСА А и В (А:В = 50:1) в качестве рабочего раствора ВСЦ.
   4. Добавьте 0,1 мл образца или стандартный раствор к 2 мл рабочего раствора BCA в микрофуге-пробирке, после чего перемешайте и затем инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут. Наконец, охладите при комнатной температуре в течение 10 минут и измерьте значение наружного диаметра_{562 нм}.
   5. Рассчитайте стандартную линейную линию (A_{562 нм} в зависимости от концентрации BSA), чтобы получить уравнение регрессии для расчета содержания белка в образце со значением A_{562 нм}.
5. Используйте 150 г лиофилизированного образца в эквиваленте белка для окрашивания серебром или 500 г белка для окрашивания в Кумасси для 18-сантиметровой полоски иммобилизованного градиента pH (IPG) pH 3-10 нелинейного (NL).
   заметка: Сухая полоса IPG имеет толщину 0,5 мм и ширину 3 мм, различную длину, включая 7, 11, 13, 18 и 24 см, и различные диапазоны pH, включая pH 4-5, 4-7, 6-9 и 3-10 в линейном или нелинейном градиенте pH. Используемый буфер IPG должен соответствовать полосе.
6. Добавьте 250 μЛ экстрагирующего буфера (7 М мочевины, 2 М тиомочевины, 4% (мас./об.) CHAPS, 100 мМ DTT (добавить перед использованием), 0,5% v/v фармалита (добавить перед использованием) и немного следов бромфенольного синего).
7. Держите раствор ниже 30 °C, затем закручивайте в течение 5 минут, обрабатывайте ультразвуком в течение 5 минут и вращайте в течение 50 минут.
8. Добавьте 110 μл регидратационного буфера (7 М мочевины, 2 М тиомочевины, 4% (по объему) CHAPS, 60 мМ DTT (добавьте перед использованием), 0,5% v/v буфера IPG (добавьте перед использованием) и немного остатков бромфенолового синего). Обрабатывайте ультразвуком в течение 5 минут. Затем вращайте образец в течение 50 минут, вращайте в течение 5 минут и центрифугируйте в течение 20 минут при давлении 15 000 x g.
9. Соберите надосадочную жидкость (350 μл) в виде раствора образца белка.

2. Двумерный гель-электрофорез

1. IEF (Первое измерение): Выполните IEF на изоэлектрической системе фокусировки, как описано ниже.
   1. Добавьте 350 мкл раствора образца белка в паз 18-сантиметрового держателя полоски IPG.
   2. Нанесите 18-сантиметровую полоску IPG гелевой стороной вниз на раствор образца белка (избегайте образования пузырьков).
   3. Добавьте 3-4 мл минерального масла, чтобы покрыть полосу IPG.
   4. Соберите держатель ленты IPG в изоэлектрическую систему фокусировки заостренным концом на задней (+) пластине и квадратным концом на передней (-) пластине.
   5. Регидратируйте на ночь (~18 ч при комнатной температуре).
   6. Установите параметры IEF: максимальный ток 30 мкА на полосу, 20 °C; 250 В, 1 ч, 125 В·ч, шаг и удержание; 1000 В, 1 ч, 500 В·ч, градиент; 8000 В, 1 ч, 4000 В·ч, градиент; 8000 В, 4 ч, 32000 В·ч, шаг и удержание; и 500 В, 0,5 ч, 250 В·ч, шаг и удержание. Дайте ему работать до 7,5 часов и 36 875 Втч.
   7. После IEF выньте каждую полоску IPG и удалите лишнее минеральное масло нерастворимым бумажным полотенцем. Теперь заверните полоску в лист полиэтиленовой пленки и храните при температуре −80 °C.
      заметка: Держатель ленты IPG следует очищать чистящим раствором держателя ленты IPG и дистиллированной водой.
2. SDS-PAGE (Второе измерение): Выполнение SDS-PAGE в системе электрофореза с вертикальной ячейкой
   заметка: Размер геля для каждой SDS-PAGE должен быть 255 x 190 x 1 мм.
   1. Используйте мультигелевый ролик для наложения гелей с разрешением 12% PAGE. Для литья 12% гелей PAGE выполните следующие действия.
      1. Добавьте 270 мл ddH₂O, 150 мл 1,5 М Tris-HCl (pH 8,8), 180 мл 40% (w/v) исходного раствора акриламида/бисакриламида (29:1, 40% w/v акриламида и 1,38% w/v N, N'-метиленбисакриламида), 3 мл 10% персульфата аммония и 150 μL TEMED для получения гелевого раствора в стакане. Аккуратно перемешивайте и избегайте образования пузырьков.
      2. Аккуратно влейте раствор геля в камеру многолитья до предполагаемой высоты геля (19 см).
      3. Немедленно добавьте около 3 мл ddH₂O на каждый растворяющий гель, чтобы покрыть гели. Дайте гелю полимеризоваться около 1 ч.
   2. Приготовьте 20 л буфера для электрофореза (25 мМ Триса, 192 мМ глицерина и 0,1% SDS). Заполните этим буфером буферный бак блока разделения электрофореза.
   3. Достаньте сфокусированные полоски IPG из морозильной камеры и уравновесьте полоски в течение 10 минут, осторожно покачивая в 4 мл буфера восстановительного равновесия (375 мМ Tris-HCl (pH 8,8), 6 М мочевины, 2% (v/v) SDS, 20% (v/v) глицерина, 2% w/v DTT (добавить перед использованием) и следы бромфенольного синего).
   4. Уравновесьте в течение 10 минут, осторожно покачивая восстановленные полоски IPG в буфере для равновесия алкилирования объемом 4 мл (375 мМ трис-HCl (pH 8,8), 6 М мочевины, 2% (v/v) SDS, 20% (v/v) глицерина, 2,5% w/v йодоацетамида (добавить перед использованием) и следование бромфенолового синего).
   5. Во время равновесия геля разберите камеру мультилитка, и выньте подготовленную фильтрующую гелевую кассету. Смойте 3x с ddH₂O. Удалите излишки ddH₂O нерастворимым бумажным полотенцем и положите в гелевую подставку.
   6. Промойте уравновешенные полоски IPG с помощью буфера для электрофореза и удалите излишки жидкости с поверхности полоски IPG нерастворимым бумажным полотенцем.
   7. Наденьте полоску IPG на разрешающий гель SDS-PAGE и пусть пластиковая сторона полоски IPG соприкоснется с более длинной стеклянной пластиной и заостренным концом слева.
   8. Быстро налейте 3-4 мл горячей 1% агарозы в буфер для электрофореза SDS (~80 °C), чтобы запечатать полоску IPG на верхней части каждого геля SDS-PAGE, и положите верхнюю сторону полоски IPG вниз на верхнюю часть более короткой стеклянной пластины без пузырьков, а затем полимеризуйте в течение 10 минут.
   9. Вставьте собранную гелевую кассету вертикально между пластиковыми прокладками в системе вертикального электрофореза. Положите верхнюю часть геля с полоской IPG рядом с катодом (−).
   10. Отрегулируйте уровень буфера для электрофореза, чтобы погрузить гелевую кассету.
   11. Подключите и переведите блок питания/управления в режим постоянного напряжения и работайте при напряжении 200 В в течение примерно 370 минут, контролируя краситель.
   12. После запуска извлеките гелевую кассету из системы электрофореза, и аккуратно извлеките гель из гелевой кассеты, избегая разрыва геля, с последующим окрашиванием 2DE-разделенных белков.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Ettan IPGphor 3	GE Healthcare		Изоэлектрическая система фокусировки.
Система Ettan DALT II	Amersham Pharmacia Biotech, Пискатауэй, Нью-Джерси, США		Система вертикального электрофореза
Держатель полосы Ettan IPGphor	Amersham Pharmacia Biotech, Пискатауэй, Нью-Джерси, США
Мультигелевый кастер Ettan DALTsix	Amersham Pharmacia Biotech, Пискатауэй, Нью-Джерси, США		Мультигелевый кастер
КимВайп	Кимвайп		Нерастворимое бумажное полотенце
Вода	Сделано с помощью инструмента PURELAB flex
Гомогенизатор Polytron Model P710/35	Brinkmann Instruments, Вестбери, Нью-Йорк
Набор для анализа белка BCA от Pierce	Thermo Fisher Scientific	No 23227
Набор 2-D Quant	GE Healthcare	80-6483-56
БИС-АКРИЛАМИД	АМРЕСКО	0172
АКРИЛАМИД	АМРЕСКО	0341
ДТТ	Сигма-Олдрич	Д0632
Тиореа	Сигма-Олдрич	Т8656
мочевина	ВЕТЭК	V900119
Паспорт безопасности	АМРЕСКО	0227
Ребята	АМРЕСКО	0465
ТЕМЕД	АМРЕСКО	М146
Персульфат аммония	АМРЕСКО	М133
Буфер IPG pH 3-10, NL	GE Healthcare	17-6000-87
Immobiline Dry Strip pH 3-10NL, 18см	GE Healthcare	Тел.: 17-1235-01