Зимографический гель-электрофорез: электрофоретический метод обнаружения матриксных металлопротеиназ путем оценки ферментативной активности

Аннотация

Источник: Hu, X. et al., Обнаружение металлопротеиназ функционального матрикса с помощью зимографии. J. Vis. Exp. (2010)

Это видео демонстрирует метод электрофореза с помощью зимографического геля для оценки активности матриксных металлопротеиназ (ММП), присутствующих в надосадочной жидкости клеточной культуры. Активные MMP разрушают специфичную для MMP подложку, встроенную в полиакриламидный гель, который после окрашивания выглядит как прозрачные полосы на темном окрашенном фоне.

Протокол

1. Загрузка и запуск геля

1. Все образцы должны быть подготовлены надлежащим образом для поддержания функции ферментов и использоваться сразу после сбора или храниться в замороженном виде при температуре -80°C. Образцы не должны содержать восстановителей (таких как β-меркаптоэтанол) или быть подвергнуты кипячению перед загрузкой гелем.
2. Откройте мешочек, содержащий гель внутри кассеты, промойте кассету деионизированной водой.
   1. Снимите защитную ленту с нижней части кассеты и расческу с верхней части геля.
   2. Промойте лунки три раза проточным буфером (разведенным до 1Х в деионизированной воде).
   3. Поместите гель в Mini-Cell, следя за тем, чтобы меньшая сторона кассеты была обращена внутрь. Зафиксируйте на месте с помощью гелевого натяжного клина. Mini-Cell позволяет запускать один или два геля параллельно.
   4. Заполните верхнюю (внутреннюю) камеру 1X работающим буфером выше уровня лунок, проверьте наличие утечек. В случае протечек снимите буфер и переместите гель на место.
   5. Заполните нижнюю камеру 1X работающим буфером.
3. Загрузите 10 мкл белкового молекулярного маркера в одну лунку.
   1. Смешайте равное количество гелезагрузочного буфера и образца и загрузите его в лунки геля с помощью наконечников для загрузки геля (меняются между каждым образцом). Эти скважины могут быть загружены общим объемом до 20 μл.
4. Установите крышку на Mini-Cell и подключите электродные шнуры к источнику питания. Включите блок питания и настройте его на постоянную работу при напряжении 125 В в течение 90 минут. Проверьте образование мелких пузырьков на проводе нижней камеры, свидетельствующих о циркуляции тока.
5. При запуске первого геля отслеживайте ход миграции каждые 15 минут, используя в качестве индикатора бромфеноловый синий, входящий в состав буфера загрузки. Дайте гелю стечь, пока индикаторный краситель не достигнет дна геля.

2. Ренатурация и проявка геля

1. Для каждого геля приготовьте 100 мл ренатурирующего буфера 1X и 200 мл денатурирующего буфера в деионизированной воде.
2. Когда бромфеноловый синий краситель для слежения достигнет дна геля, выключите источник питания, откройте мини-ячейку и извлеките гель. Разделите две стороны кассеты с помощью гелевого ножа (или весового шпателя). Отрежьте уголок, чтобы отметить направление геля.
3. Осторожно извлеките гель из кассеты и поместите в емкость с ренатурирующим буфером объемом 100 мл. Выдерживать 30 минут при комнатной температуре при слабом перемешивании.
4. Удалите ренатурирующий буфер и добавьте в гель 100 мл проявляющего буфера. Выдерживать 30 минут при комнатной температуре при слабом перемешивании.
5. Удалите проявочный буфер и добавьте в гель еще 100 мл проявочного буфера. Инкубировать в течение ночи (16-18 часов) при температуре 37°C.
6. Удалите проявляющий буфер и промойте три раза (по 5 минут) деионизированной водой при слабом перемешивании при комнатной температуре.
7. Отсканируйте гель, чтобы сохранить точное расположение стандартных полос белка, так как они станут менее заметными или не будут видны после окрашивания гелем.
8. Окрасьте гель, добавив в гель 20 мл SimplyBlue Safestain. Выдерживать в течение 1 часа при комнатной температуре при слабом перемешивании.
9. Удалите SimplyBlue SafeStain и удалите пятна с геля в 100 мл или более деионизированной воды в течение одного часа при комнатной температуре при слабом перемешивании.
10. Для достижения лучших результатов замените ее свежей деионизированной водой и выдерживайте еще час или более при комнатной температуре при слабом перемешивании.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Аппарат для электрофореза Xcell SureLock Mini-Cell CE	Инвитроген	ЭИ0001
Блок питания (модель 302)	ВВР	93000-744
Novex 10% гели для желатиновой зимограммы, 1,0 мм, 12 лунок	Инвитроген	EC61752BOX
Буфер для загрузки геля Blue Juice	Инвитроген	10816015
Советы по загрузке гелем	ВВР	53509-015
Стандарт молекулярной массы белка	Инвитроген	ЛК5800
Беговой буфер Novex Tris-Glycine-SDS	Инвитроген	ЛК2675
Ренатурирующий буфер для зимограммы Novex	Инвитроген	ЛК2670
Буфер для проявки зимограммы Novex	Инвитроген	ЛК2671
SimplyBlue SafeStain	Инвитроген	ЛК6060