Мультианалитный иммуногранулатический анализ: метод проточного иммуноанализа для одновременного обнаружения нескольких подтипов антител в образце сыворотки крови человека

Аннотация

Источник: Fhied, C. L. et al., Динамический мониторинг сероконверсии с использованием мультианалитного иммуногранулометрического анализа для Covid-19. J. Vis. Exp. (2022).

Это видео описывает метод иммунологического анализа с использованием флуоресцентных магнитных шариков или микросфер в сочетании с различными антигенами для одновременного обнаружения различных изотипов антител в образце сыворотки. Анализ полезен для понимания сероконверсии во время инфекции или после вакцинации.

Протокол

Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.

1. Получение антиген-конъюгированных микросфер

1. Выберите три разных флакона с магнитными микросферами с уникальными областями шариков, записывая идентификатор шарика и информацию о партии для каждого используемого флакона.
   заметка: Следующие шаги будут выполнены для каждой отдельной области микросферы. Микросферы светочувствительны и должны быть защищены от длительного воздействия света. Во время промывки будьте осторожны, чтобы не потревожить микросферы. Если вас потревожат, подождите еще 60 секунд интервала.
2. Вортексируйте микросферный материал в течение 60 с и обработайте ультразвуком в течение 5 мин перед использованием для диссоциации агрегированных шариков.
3. Переложите 1,0 x 10⁶ шариков в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл с низким содержанием белка.
4. Вставьте трубку в магнитный сепаратор и дайте отделителю произойти в течение 60 с. Когда трубка все еще находится в магнитном сепараторе, осторожно удалите надосадочную жидкость, не потревожив гранулу гранул.
5. Извлеките трубку из магнитного сепаратора, повторно суспендируйте шарики в 100 μл воды класса ВЭЖХ и сделайте вихрь в течение 30 с. Поместите трубку обратно в магнитный сепаратор на 60 с, а затем удалите надосадочную жидкость. Повторите этот протокол стирки дважды.
6. Извлеките трубку из магнитного сепаратора и повторно суспендируйте промытые микросферы в 90 мкл 100 мМ одноосновного фосфата натрия, pH 6,2 (буфер активации) вихревым способом в течение 30 с.
7. Добавьте 10 мкл 50 мг/мл Sulfo-NHS (разбавленного активационным буфером) к микросферам и осторожно вортексируйте в течение 10 с. Добавьте 10 мкл 50 мг/мл раствора EDC (разбавленного активационным буфером) и осторожно вортексируйте в течение 10 с. Инкубируйте микросферы в течение 20 мин при комнатной температуре (RT) с легким вихрем каждые 10 мин.
8. Повторите шаги промывки 1,4-1,5 с 50 мМ MES, pH 5,0 (буфер для связи) вместо воды класса LC/MS, всего два промывки.
9. Извлеките трубку из магнитного сепаратора и повторно суспендируйте шарики со 100 мкл буфера для связи вихрем в течение 30 с с последующим немедленным добавлением желаемого количества белка.
10. Доведите общий объем до 150 мкл с помощью буфера для связи. Реакция смешивания вихревым соединением в течение 30 с и инкубация в течение 2 ч вращением при RT.
    заметка: Для анализов, определенных в настоящем документе, конъюгации проводили со следующими концентрациями белка: Spike S1: 5 мкг; Нуклеокапсид: 5 мкг; Мембрана: 12,5 мкг.
11. Повторите шаг мытья 1.4 с фосфатно-соевым буфером (PBS)-1% альбумином козьей сыворотки, 0,01% полисорбатом-20 (буфер для гашения) вместо воды класса LC/MS, всего два промывания. Ресуспендируйте промытые микросферы в 100 мкл закалочного буфера, содержащего 0,05% азида натрия, вихревым действием в течение 30 с.<бр/> заметка: Дайте шарикам полностью закалиться в течение не менее 6 часов, прежде чем приступать к любой другой процедуре.
12. Подсчитайте количество восстановленных микросфер с помощью автоматизированного счетчика клеток или гемоцитометра. Запишите наблюдаемую концентрацию шариков.
13. Охладите связанные микросферы при температуре 4 °C в темноте.

2. Процедуры

1. Производительность анализа (Базовый протокол)
   1. Ресуспендирование связанных микросфер вихревым путем в течение 30 с и ультразвуковой обработкой в течение ~60-90 с.
   2. Удалите необходимое количество коллоида каждого шарика из соответствующей пробирки и соедините коллоиды шариков в новой микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл.
   3. Вставьте трубку в магнитный сепаратор и дайте отсоединиться в течение 60 секунд. Когда трубка все еще находится в магнитном сепараторе, осторожно удалите надосадочную жидкость, не потревожив гранулу гранул.
   4. Извлеките шарики из сепаратора, повторно суспендируйте гранулы 100 μл PBS-1% бычьего сывороточного альбумина, 0,01% Polysorbate-20 (буфер для анализа) и перемешайте в течение 30 с. Поместите пробирку в магнитный сепаратор и дайте произойти разделению в течение 60 с. Повторите этот протокол промывки (т.е. шаги 2.1.3-2.1.4) дважды.
   5. Отрегулируйте концентрацию 3-плексной рабочей микросферной смеси, добавив соответствующий объем буфера для анализа, чтобы получить конечную концентрацию 100 микросфер на 1 мкл для каждой мишени.
   6. Аликвоту 12,5 мкл смеси микросфер, приготовленной на стадии 2.1.5, в каждую лунку 384-луночного планшета или 25 мкл в каждую лунку 96-луночного планшета.
   7. Разбавьте образцы плазмы/сыворотки в 500 раз в буфере для анализа. Подготовьте стандартные образцы в соответствии с желаемым титрованием.
   8. Добавьте 12,5 мкл пробирного буфера в качестве пустого образца и добавьте каждый из разбавленных образцов или эталона в каждую предназначенную лунку 384-луночного планшета или 25 μл пустого, разбавленного образца или стандарта в каждую лунку 96-луночного планшета для образцов.
   9. Накройте пластину алюминиевым уплотнением или фольгой и выдерживайте в течение 1 ч при температуре RT на вибростенде, установленном на 700 об/мин.<бр/> заметка: Схема кривых разрежения представлена в таблице 1.
   10. Приготовьте раствор антител против обнаружения человека (вторичные растворы антител) в концентрации 4 мкг/мл с буфером для анализа, как указано на шаге 2.1.11.
   11. Препарат Козлиный античеловеческий IgM, конъюгированный с IgA Super Bright 436 (SB)/Goat-anti-human, конъюгат Phycoerythrin (PE) обнаруживает антитела в концентрации 4 г/мл; или Goat-anti-human IgM, конъюгат SB/Козелий-античеловеческий IgG, конъюгат PE обнаруживает антитела в конъюнктуре 4 мкг/мл.
       заметка: Для формата с 384 лунками требуется 12,5 мкл/лунка приготовленного раствора вторичного антитела, а для формата с 96 лунками требуется 25 мкл/лунка.
   12. Поместите пластину на магнитный сепаратор, быстро промойте и с силой переверните контейнер для биологически опасных веществ, чтобы удалить жидкость из лунок. Не переворачивая тарелку, с силой постучите ее по толстому комку бумаги.
   13. Промойте каждую лунку 100 мкл буфера для анализа и удалите жидкость путем принудительной инверсии над контейнером для биологически опасных веществ, как описано ранее. Повторите эти шаги (2.1.12-2.1.13) в общей сложности два стирки. Выбросьте все использованные пачки бумаги в контейнер для биологически опасных веществ.
   14. Добавьте 12,5 мкл рабочего раствора вторичного антитела в каждую лунку 384-луночного планшета или 25 мкл в каждую лунку 96-луночного планшета. Накройте пластину алюминиевым уплотнителем или фольгой и инкубируйте в течение 30 минут при температуре RT на вибростенде, установленном на 700 оборотов в минуту.
   15. Повторите шаги стирки 2.1.12-2.1.13.
   16. Добавьте 75 мкл буфера для анализа в каждую лунку 384-луночного планшета или 100 мкл в каждую лунку 96-луночного планшета. Накройте пластину алюминиевым уплотнителем или фольгой и выдерживайте в течение 5 минут при RT на встряхивателе для тарелок, установленном на 700 оборотов в минуту.
   17. Проанализируйте 60 мкл с помощью приборного анализатора в соответствии с инструкцией по эксплуатации.

Таблица 1: Серия разведения для стандартных кривых: Таблица коэффициентов разведения, используемых для стандартных кривых для серотипа IgG; представлена в виде 7-точечной последовательной кривой разведения 1:5, начиная с 1 мкг/мл для α-Spike S1 и α-нуклеокапсида и 5 мкг/мл для антител α-мембраны.

Стандартный номер	Серия разбавлений	Anti-Spike S1 или N (μг/мл)	Антимембранный (μг/мл)
пустой	пустой	- T	- T
1	СТД7 1:1	1	5
2	СТД6 1:5	0,2	1
3	СТД5 1:25	0,04	0,2
4	СТД4 1:125	0,008	0,04
5	СТД3 1:625	0,0016	0,008
6	СТД2 1:3125	0,00032	0,0016
7	СТД1 1:15625	0,000064	0,00032

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
384-луночные черные боковые полистирольные микротитровальные пластины	Термо Фишер	Тел.: 12-565-346
Активационный буфер (0,1 М NaH2PO4, pH 6,2)	Готовится на месте
Буфер для анализа (PBS, 1% бычьего сывороточного альбумина, 0,01% полисорбат-20)	Готовится на месте
Бычья сыворотка альбумин, фракция теплового шока	МиллипорСигма	А-7888-50Г
Буфер для связывания (50 мМ MES, pH 5,0)	Готовится на месте
COVID 19 M Коронавирус Рекомбинантный матричный белок (6xHistag)	МойБиоИсточник	MBS8574735
Одноразовые наконечники для пипеток
EDC (1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимида гидрохлорид)	Термо Фишер	PIA35391
Козий альбумин, порошок фракции V	Миллипора Сигма	А2514-1Г
IgA козий античеловек, R-PE, поликлон	Термо Фишер	OB205009
IgG козий античеловеческий, R-PE, поликлональный	Термо Фишер	OB204009
IgG козий антикроличий, R-PE, поликлональный	Термо Фишер	OB403009
gM Козий античеловеческий, R-PE, поликлональный	Термо Фишер	OB202009
IgM Мышь античеловек, SB 436, клон SA-DA4	Термо Фишер	62999842
Приборный анализатор	Корпорация «Люминекс»	ИНТЕЛЛИФЛЕКС-РУО
Микроцентрифужные пробирки с низким уровнем связывания (1,5 мл)	Термо Фишер	Тел.: 13-698-794
Микросферы MagPlex-C, Регион XXX	Корпорация «Люминекс»	MC10XXX-01
MES гидрат (2-(N-морфолино)этан сульфоновый гидрат)	МиллипорСигма	М2933
Микропластинчатая алюминиевая уплотнительная лента	Термо Фишер	Тел.: 07-200-683
Полисорбат-20	Термо Фишер	БП337-500
Quality Biological Inc. PBS, pH 7,2	Термо Фишер	Тел.: 50-751-7328
Буфер для гашения (PBS, 1% альбумин козьей сыворотки, 0,01% полисорбат-20)	Готовится на месте
Нуклеокапсидный белок SARS-CoV-2 (2019-nCoV) (метка His)	Синобиологические препараты	40588-V08B
Спайковый белок SARS-CoV-2 (2019-nCoV) (субъединица S1, метка His)	Синобиологические препараты	40591-В08Н
Антитела к SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD, Rabbit pAb	Синобиологические препараты	40592-Т62
Антитело к нуклеокапсиду SARS-CoV-2 (2019-nCoV), mAb кролика	Синобиологические препараты	40588-Р0004
SARS-CoV-2 (COVID-19) Мембранные антитела (IN), Rabbit pAb	ProSci	10-516
Сульфо-NHS (N-гидроксисульфосукцинимид)	Термо Фишер	PIA39269
Буфер для промывки (PBS, 0,01% полисорбат-20)	Готовится на месте
Вода, класс LC/MS	Термо Фишер	Ш-64