Анализ активности фосфолипазы: анализ диффузии геля для определения активности фосфолипазы в экстракте сырого яда из Anthopleura dowii

Аннотация

Источник: Ramírez-Carreto, S., et al., Идентификация гемолитической и фосфолипазной активности в сырых экстрактах из морских анемонов с помощью прямых биоанализов. J. Vis. Exp. (2022)

В этом видео мы демонстрируем анализ для установления наличия фосфолипазы в экстракте сырого яда Anthopleura dowii — морского морского анемона. В анализе используется метод диффузии агарозного геля, при котором фермент фосфолипаза диффундирует и расщепляет фосфолипиды, включенные в твердую среду, радиальным образом.

Протокол

1. Коллекция организмов

1. Сбор актинии A. dowii.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь организмы были собраны во время отливов в приливной зоне у побережья Энсенада-Баха, Калифорния, Мексика (рис. 1A, B). 
2. Транспортируйте организмы в лабораторию в контейнерах с морской водой (рис. 1C).
3. В лаборатории очистите организмы дистиллированной водой вручную, чтобы удалить крупные частицы субстрата, прилипшие к телу.
4. Немедленно заморозьте организмы при температуре -80 °C в ультраморозильной камере на 72 часа.
5. Поместите микроорганизмы в специальные стаканы для сублимационной сушки с условиями лиофилизации -20 °C, 0,015 фунта на квадратный дюйм, в течение 48 часов.
6. Храните лиофилизированные организмы при температуре -20 °C до использования.

2. Увлажнение тканей

1. Восстановите 20 г сухой массы лиофилизированных организмов с 60 мл (1/3 мас./об.) буфера 50 мМ фосфата натрия, pH 7,5 и 1 таблетку коктейля ингибитора (Таблица материалов).
2. В магнитной мешалке непрерывно перемешивайте образец со скоростью ~800 об/мин, 4 °C, в течение 12 часов.

3. Выброс токсинов

1. Чтобы вызвать лизис клеток и разряд нематоцисты, заморозьте образец при температуре -20 °C на 12 часов, а затем поместите контейнер в воду комнатной температуры (RT) до тех пор, пока он не оттает до 90%. Повторите эту процедуру три раза.
   заметка: Проба не оттаивает на 100%; крайне важно поддерживать образец при температуре ~4 °C, чтобы предотвратить деградацию белка.
2. Понаблюдайте за отделяемой нематоцистой под конфокальным микроскопом. Возьмите 10 мкл образца на предметное стекло и наденьте на него покровное стекло. Наблюдайте под конфокальным микроскопом при 100-кратном и 60-кратном увеличении. Здесь краситель не был нужен.
3. Обработка изображений, полученных в конфокальный микроскоп в программном обеспечении ImageJ (версия 1.53c, Wayne Rasband, National Institutes of Health, США, https://imagej.nih.gov/ij).
4. Если канальец внутри нематоцисты разматывается и находится снаружи, нематоцисты отделяются; затем перейдите к следующему этапу. В противном случае проведите только еще один цикл заморозки-оттаивания.
5. Чтобы осветлить экстракт, центрифугируйте образец при температуре 25 400 x g в течение 40 мин, 4 °C, восстановите надосадочную жидкость и снова центрифугируйте его. Повторите этот шаг 3-4 раза.
6. Восстановите надосадочную жидкость и выбросьте гранулы. Надосадочная жидкость или сырой экстракт содержит компоненты яда (токсины) и другие молекулы клеток, такие как липиды, углеводы и нуклеиновые кислоты.

4. Количественное определение общего белка

1. Определите концентрацию белка в сыром экстракте с помощью коммерческого колориметрического набора Брэдфорда (Таблица материалов).
2. Разведите реагент красителя (одну часть красителя с четырьмя частями дистиллированной воды).
3. Приготовьте раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) фракции V (Таблица материалов) в концентрации 1 мг/мл в фосфатном буфере (50 мМ фосфата натрия, pH 7,5).
4. Приготовьте растворы, перечисленные в таблице 1, в трех экземплярах.
5. Энергично перемешайте каждый раствор в шейкере в течение 4 с.
6. Инкубируйте образцы в течение 5 мин при RT, не встряхивая.
7. Измерьте поглощение (AU) на длине волны 595 нм.
8. Построить график средних значений поглощения БСА в образце (AU в зависимости от концентрации белка) и определить уравнение графика (уравнение 1).
   
   где y — поглощение, m — наклон линии, x — концентрация белка, а b — y-пересечение. Чтобы рассчитать концентрацию сырого экстракта, решите для x следующим образом:
   

5. Определение сложности полипептидного яда

1. Соберите стеклянную емкость для вертикального гель-электрофореза в соответствии с инструкцией.
2. Приготовьте акриламидную смесь (30%): 29,2 г акриламида, 0,8 г бис-акриламида, итоговый объем 100 мл. Отфильтруйте раствор с помощью мембраны 0,45 мкм. Храните раствор в темной бутылке при температуре 4 °C. Затем приготовьте смесь для рассасывающего геля (Таблица 2).
3. Гель SDS-PAGE состоит из разрешающего геля и стекирующего геля. Приготовьте гели в соответствии с объемами раствора, определенными в таблице 2. Во время приготовления следите за тем, чтобы температура каждой смеси составляла 4 °C, чтобы сократить время полимеризации.
   заметка: Объем каждой смеси варьируется в зависимости от марки используемого оборудования; для данного протокола объемы соответствуют приготовлению 15% акриламидного геля толщиной 0,75 мм для камеры вертикального электрофореза (Таблица материалов).
4. После того, как акриламид полимеризуется, ~10 минут, добавьте в смесь стекинговый гель.
5. Приготовьте смесь для укладки геля, сразу же добавьте его на стеклянные пластины и поставьте гребень, чтобы сформировать лунки для загрузки образцов.
6. Как только стекляющий гель полимеризуется (~15 минут), снимите расческу и поместите стеклянный контейнер в камеру для вертикального электрофореза.
7. Поместите 200 мл электродного буфера (0,25 М Трис, 0,192 М глицина, 0,1% SDS) в камеру электрофореза.
8. Проанализируйте сырой экстракт: смешайте 30 μг сырого экстракта с 5 μL белкового буфера (25% глицерина, 15% додецилсульфата натрия, 25% 2-меркаптоэтанола, 0,125 мМ Tris pH 7, бромфеноловый синий 0,1 мг/мл) для денатурации белков. Конечный объем должен составлять <50 μл.
9. Нагрейте до 90 °C в течение 5 минут, охладите и центрифугируйте в течение 3 с при 1 400 x g. 10. Загрузите образцы в лунки для укладки геля. Загрузите стандартную молекулярно-весовую лестницу.
10. Загрузите образцы в лунки для укладки геля. Загрузите стандартную молекулярно-весовую лестницу.
11. Запустите электрофорез при постоянном давлении 25 мА в течение 1 часа 30 минут.
12. Извлеките стеклянные емкости из камеры электрофореза, чтобы приступить к окрашиванию гелевых белков.

6. Окрашивание белка

1. Промойте гель в 50 мл дистиллированной воды, чтобы удалить мусор с буферного электрода.
2. Слейте воду.
3. Чтобы избежать диффузии белков геля, добавьте раствор фиксации (60 мл этанола, 20 мл уксусной кислоты и 20 мл дистиллированной воды, конечный объем 100 мл). Инкубировать при RT в течение 40 мин с встряхиванием при 80 об/мин. Сцедите раствор.
4. Добавьте раствор белкового сшивающего слоя (15 мл этанола, 0,25 мл глутарового альдегида, 50 мл дистиллированной воды, конечный объем 65,25 мл) и инкубируйте в течение 30 мин при РТ с встряхиванием при 80 об/мин. Удалите раствор.
5. Смойте гель 100 мл дистиллированной воды в течение 5 минут и удалите воду. Повторите эту процедуру четыре раза.
6. Провести окрашивание белков 50 мл фильтрованного раствора Coomassie brilliant blue R-250 (40% метанола, 10% уксусной кислоты, 50% дистиллированной воды, 0,1% красителя, конечный объем 100 мл), перемешивая при 60 об/мин в лабораторном ротационном генераторе при РТ в течение 15 мин.
7. Восстановите раствор, который можно использовать для окрашивания других гелей.
8. Для устранения излишков красителя добавьте раствор для задержания (40 мл метанола, 10 мл уксусной кислоты, 50 мл дистиллированной воды). Продолжайте помешивать (80 об/мин) при RT до тех пор, пока полосы (окрашенные белки) не станут визуализированы.
9. Держите гель в 50 мл дистиллированной воды и отсканируйте изображение в системе документирования геля.

7. Анализ фосфолипазы

1. Одно куриное яйцо промыть с 1% SDS в дистиллированной воде.
2. Отделите яичный желток от яичного белка в стерильных условиях.
3. Приготовьте 50 мл 0,86% раствора NaCl и профильтруйте через фильтр 0,22 мкм. Затем приготовьте раствор А: Добавьте 12 мл яичного желтка и 36 мл 0,86% раствора NaCl.
4. Приготовьте раствор В: Смешайте 300 мг агарозы с 50 мл буфера (50 мМ Трис, pH 7,5), профильтруйте через фильтр 0,22 мкм. Нагрейте раствор в микроволновой печи до закипания. Остудите в теплой воде до 43-45°C.
5. Приготовьте раствор C: Приготовьте 10 мМ CaCl2 и отфильтруйте его с помощью фильтра 0,22 мкм.
6. Приготовьте раствор D: 10 мг родамина 6G в 1 мл дистиллированной воды.
7. В стерильных условиях (ламинарный вытяжной шкаф) добавьте 500 мкл растворов А и С в раствор В и 100 мкл раствора D, перемешайте и налейте по 25 мл в каждую чашку Петри (90 х 15 мм).
8. Подождите, пока раствор застынет в стерильных условиях (30 мин).
9. Сделайте лунки (диаметром ~2-3 мм) тонкой трубкой.
10. Добавьте в общей сложности 20 мкл фосфатного буфера (отрицательный контроль) в одну лунку и 20 мкл определенной фосфолипазы (положительный контроль) в другую лунку.
11. Поместите различное количество сырого белка экстракта, 5, 15, 25, 35, 45 мкг, в остальные лунки, каждая в конечном объеме 20 мкл.
12. Подождите, пока агар адсорбирует все образцы (30 мин).
13. Выдерживать при температуре 37 °C в течение 20 часов.
14. Если вокруг колодца образуется ореол, это говорит об активности фосфолипазы. Измерьте сформированный ореол с помощью штангенциркуля.
    заметка: Проведите эксперимент в трех экземплярах (шаги с 7.1-7.14).

Результаты

Рисунок 1: Коллекция морских анемонов. (A) Приливная зона в Эль-Саусаль, Нижняя Калифорния, Северная Калифорния, Мексика. (Б) Собраны морские анемоны. (C) Anthopleura dowii Verrill, 1869.

Таблица 1: Количественное определение белка по методу Брэдфорда.

...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Коническая центрифужная пробирка 15 мл	Корнинг	430766
2-бромфеноловый синий	сигма	В75808
2-меркаптоэтанол	Сигма-Олдрич	М6250-100МЛ
Конические центрифужные пробирки объемом 50 мл	Корнинг	430828
Уксусная кислота ледяная	Джей Ти Бейкер	9515-03
Акриламид	Компания Promega	В3115
агароза	Компания Promega	В3125
Бисаакриламид	Компания Promega	В3143
Бычья сыворотка альбумина фракция V	сигма	А3059-100Г
Брадфордские анализы белка	Био-Рад	5000006
Хлорид кальция	Сигма-Олдрич	С3306
Планшеты для клеточных культур 96 луночные, V-образное дно	Корнинг	No 3894
центрифуга	Эппендорф	5804Р
Центрифужные пробирки	Корнинг	CLS430829
Система ChemiDoc MP	Био-Рад	1708280
лимонная кислота	Сигма-Олдрич	251275
Прозрачные 96-луночные планшеты с плоским дном	Термо Сайентиал	No 3855
Кумасси Бриллиантовый Синий G-250	Био-Рад	#1610406
Кумасси бриллиантовый синий R-250	Био-Рад	1610400 (Английский
глюкоза	Джей Ти Бейкер	1916-01
Корпус без воздуховодов	Лабконко	вертикальный	https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c
Гель Док ЭЗ	Био Рад.		Система документирования геля
глицерин	Сигма-Олдрич	Г5516-4Л
Гемоцитометр	Мариенфельд	650030
ImageJ (программное обеспечение)	NIH, США	Версия 1.53c
Инкубатор 211	Лабнет	И5211 ДС
метанол	Джей Ти Бейкер	9049-03
Мини-PROTEAN тетраклетка	Био-Рад	1658000EDU
На2НПО4	Джей Ти Бейкер	3824-01
NaCl	Джей Ти Бейкер	3624-01
NaH2PO4.H2O	Джей Ти Бейкер	3818-05
Программное обеспечение Origin		версия 9	Проектирование участка с сигмоидальными корректировками
Петридиш	сокол	351007
Набор Пипетмана	Гилсон	F167380
Сборный мини-гель	БиоРад	1658004
Предварительно окрашенный протеиновый лестник	Термо Сайентиал	No 26620
Коктейль ингибиторов протеазы	Рош	11836153001
Концентрат красителя для анализа белка	Био-Рад	5000006
Родамин 6G	Сигма-Олдрич	252433
Паспорт безопасности	Сигма-Олдрич	Л4509
Цитрата натрия дигидрат	Джей Ти Бейкер	3646-01
спектрофотометр	ТЕРМОНАУЧНАЯ	G10S В УФ-ВИЗ
База Трис	Сигма-Олдрич	77-86-1 (Английский
Вольтовый источник питания	Хофер	PS300B