1. Изготовление штампов на основе полидиметилсилоксана (PDMS)
- Нарисуйте массив микромасштабных колец с помощью программного обеспечения САПР с внутренним диаметром 250 μм и внешним диаметром 450 μм. Шаблон, используемый в этом протоколе, представляет собой матрицу 10 x 10 с расстоянием между кольцами 850 мкм.
- Распечатайте маску прозрачности узора с нужным разрешением с помощью службы печати масок микропроизводственной компании (см. Таблицу материалов).
заметка: Доказано, что предоставленные размеры кольца работают со многими типами ячеек.
- Проведите ультрафиолетовую (УФ) фотолитографию с использованием маски, содержащей желаемые характеристики, чтобы создать форму негативного фоторезиста (например, SU-8).
- Накройте кремниевую пластину, покрытую фоторезистом, прозрачной маской, изготовленной на шагах 1.1-1.2.
- На УФ-контактном элайнере полимеризуйте фоторезист под прозрачными областями маски под действием ультрафиолетового света.
заметка: После дальнейшей промывки и разработки изготавливается мастер-форма с желаемыми характеристиками. Эксплуатационные детали зависят от конкретного используемого оборудования.
- Приготовьте эластомерные преполимеры PDMS, смешав с его отвердителем в соотношении 10:1, а затем отлите смесь на форму в чашке Петри.
- Поместите форму в вакуумную камеру на 30 минут, чтобы удалить пузырьки воздуха в PDMS, и запекайте в духовке при температуре 60 °C не менее 2 часов.
- После полного отверждения PDMS разрежьте массивы шаблонов на штампы.
заметка: Более толстые штампы (около 1 см) могут быть предпочтительными из-за простоты работы на более поздних этапах микроконтактной печати.
2. Покрытие стекол
- Очистите стекла предметными стеклами. Замочите горки в ванне со 100% этанолом, обработайте ультразвуком 5 минут, а затем смойте водой.
- Повторите этот шаг сначала с ацетоном, затем с изопропанолом с последующей сушкой в потоке азота.
- Используйте электронно-лучевое испарительное оборудование (E-beam) для нанесения слоев титана и золота на стеклянные предметные стекла.
заметка: Для титанового слоя желаемая толщина составляет 15 Å (1 Å = 10-10 м). Для золотого слоя желаемая толщина составляет 150 Е. Сначала покройте титан, а затем золото, так как титановый слой служит клеем между золотом и предметным стеклом.
- Поместите очищенные стекла в испарительную камеру и вставьте золотые и титановые тигли под затворы.
- Откачайте камеру для создания вакуума ниже 10-5 Па перед плавлением металлов. Сфокусируйте электронный луч на металле и отрегулируйте мощность таким образом, чтобы скорость осаждения соответствовала толщине напыления.
- Откройте затвор, чтобы начать напыление металла. Закройте жалюзи, когда будет достигнута желаемая толщина.
- Переключение тиглей между последовательным испарением двух металлов.
- Подождите, пока тигли остынут, как того требует оборудование, проветрите камеру и выньте стеклянные стекла с золотым покрытием.
- Снова откачайте камеру для обслуживания оборудования.
заметка: Эксплуатационные детали могут зависеть от конкретного электронно-лучевого испарителя. Важно иметь хорошо контролируемую, низкую скорость осаждения титана. Толстый слой титана часто приводит к плохой видимости, особенно при флуоресцентной визуализации клеток. После нанесения покрытия стеклянные стекла с титаново-золотым напылением можно хранить в сухой вакуумной камере при комнатной температуре не менее 1 месяца.
3. Микроконтактная печать
- При желании разрежьте предметное стекло с титаново-золотым напылением на более мелкие кусочки. Для типичного применения рекомендуется использовать квадратную форму размером 12 мм x 12 мм (рис. 1B).
- Используйте стеклорез, чтобы скользить по поверхности, чтобы оставить вмятину на следе, затем держите стекло с обеих сторон и согните вмятину, чтобы разбить ее на небольшие четверти. Избегайте прикосновения к поверхности, покрытой золотом.
заметка: Чтобы визуально определить, с какой стороны стекла находится поверхность с покрытием в случае случайного опрокидывания, сравните отражение света с обеих сторон. Покрытая золотом поверхность будет иметь более яркое отражение, в то время как сторона без покрытия будет иметь более тусклое отражение (от слоя титана на другой стороне стекла). Альтернативным способом является наблюдение за краями ползуна, а сторону покрытия можно определить по вертикальной поверхности реза.
- Очистите предметные стекла, замочив их в 100% этаноле в чашке Петри золотой стороной вверх на орбитальном вибростенде не менее чем на 10 минут. Отсадите этанол, затем высушите каждое предметное стекло, обдувая его струей азота.
- Очистите штампы PDMS мыльной водой, а затем 100% этанолом. Высушите штампы газообразным азотом.
- Приготовьте 2 мМ раствор октадеканэтиола (С18) путем растворения 5,74 мг порошка С18 в 10 мл 100% этанола.<бр/>
заметка: Закройте и храните раствор C18 при комнатной температуре. Печать шаблонов с помощью C18 создает адгезивный самоорганизующийся монослой, к которому преимущественно прикрепляются фибронектин и клетки.
- Замочите штампы PDMS в растворе C18 узорчатой поверхностью вниз в течение 10 с и аккуратно высушите газообразным азотом в течение 60 с.<бр/>
заметка: При сушке сначала отведите струю от штампа (около 1 м), пока большая часть жидкости не испарится, а затем медленно переместите струю ближе, чтобы полностью высушить штамп. Это сделано для того, чтобы раствор C18 не сдувался, а не высыхал на штампе.
- Положите клеймо лицевой стороной вниз на золотые предметные стекла на 60 с перед снятием.
- Чтобы обеспечить правильное тиснение, аккуратно постучите пинцетом по штампам, чтобы правильно перенести узоры. Не нажимайте слишком сильно, а вес пинцета обычно достаточен.
заметка: Визуальный осмотр штампа во время постукивания позволит убедиться в равномерном контакте штампа и предметного стекла.
- Подготовьте камеры влажности.
- Внесите пипеткой 1 мл 70% этанола в перевернутую крышку чашки Петри и положите кусок парапленки, чтобы покрыть поверхность (покрытой лицевой стороной вверх).
- Используйте пинцет для подъема, положите парапленку, чтобы убедиться в отсутствии пузырьков воздуха, и при необходимости удалите излишки этанола.
- Приготовьте 2 мМ раствор HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3): Разведите 5 мкл стокового раствора в 5 мл 100% этанола.
заметка: Разбавленный раствор EG3 можно запечатать и хранить при температуре 4 °C, а неразбавленный запас EG3 следует хранить при температуре -20 °C. Обработка EG3 используется для того, чтобы сделать область стекла без C18 неадгезией к клеткам.
- Микропипетки объемом 40 мкл капель EG3 на каждую четверть стекла наносятся на парапленку в камере влажности, оставляя достаточно места между каплями, чтобы учесть расстояние между золотыми предметными стеклами.
- С помощью пинцета поместите золотые предметные стекла, напечатанные C18, лицевой стороной вниз на капли и убедитесь, что под ними нет пузырей. Аккуратно сдвиньте предметные стекла вместе, не поднимая их, чтобы свести к минимуму испарение.
заметка: Поместите один край стакана скольжением вниз рядом с каплей, а затем, медленно опуская другой конец стакана, спустите вниз. Если пузырь присутствует, нажмите на золотое стекло, не поднимая его, пока пузырь не исчезнет.
- Плотно закройте чашку Петри парапленкой и оставьте при комнатной температуре не менее чем на 3 ч.<бр/>
заметка: Если требуется обширная инкубация, дважды запечатайте чашку Петри и оставьте ее на срок до 24 часов.
- В шкафу биобезопасности поместите золотые предметные стекла лицевой стороной вверх в чашку Петри, замочите и промойте 3 раза в 70% этаноле для удаления EG3, затем оставьте в этаноле на 10 минут для стерилизации.
- Отсадите этанол и замените его стерильным PBS.
- Подготовьте еще одну камеру влажности, как описано в шаге 3.9, с PBS вместо этанола.
заметка: Из-за разницы в поверхностном натяжении проще сначала добавить 4-5 мл PBS для укладки парапленки и удаления пузырьков, а затем отсасывать излишки.
- Приготовьте раствор фибронектина в концентрации 50 мкг/мл (при желании другие белки) в стерильном PBS и микропипетке. Капли 50 мкл раствора фибронектина на каждую четверть нанесите на парапленку, оставляя некоторое пространство между каплями.
заметка: Покрытие из фибронектина способствует адгезии клеток к узорчатым поверхностям.
- Используйте вафельный пинцет, чтобы поместить предметные стекла лицевой стороной вниз на капли и убедитесь, что под ними не образуются пузырьки. Аккуратно сдвиньте слайды друг с другом, не поднимая их.
заметка: Для работы с предметными стеклами рекомендуется использовать пинцет со стеклянными предметными стеклами или вафельный пинцет с прямыми широкими наконечниками.
- Оставьте чашку Петри в шкафу биобезопасности на 30 минут.
- Через 30 минут поместите золотые слайды лицевой стороной вверх в PBS после 3 полоскания.
заметка: Предметные стекла с рисунком фибронектина могут храниться в PBS при температуре 4 °C около месяца.
4. Засеивание ячеек на микроструктурированные слайды
- Нагрейте питательную среду для клеточных клеток и трипсин на водяной бане при температуре 37 °C.
заметка: Следующее описание субкультуры относится к клеткам NIH/3T3. Условия культивирования могут варьироваться в зависимости от типа клеток.
- (Необязательно) Замочите узорчатые стекла в питательных средах в 12-луночном планшете, нагрейте до 37 °C в инкубаторе перед трипсинизацией клеток для лучшего прикрепления клеток.
- Трипсинизируйте клетки, нейтрализуйте с помощью среды, содержащей FBS, центрифугируйте при 100 x g в течение 3 минут, а затем повторно суспендируйте, хорошо перемешав со свежей средой><.
заметка: Убедитесь, что клетки полностью диссоциированы друг от друга.
- Подсчитайте клетки, разбавьте до 200 000 клеток/мл и добавьте 0,5 мл клеточной суспензии в каждую лунку, содержащую одно золотое стекло.
- Осторожно встряхните лунную пластину несколько раз для равномерного посева клеток и храните ее в инкубаторе в течение 15 минут, чтобы обеспечить прикрепление клеток.
- Через 15 мин проверьте прикрепление клетки под микроскопом. При необходимости выделите дополнительное время.
заметка: Прикрепленные ячейки будут располагаться на поверхности с видимым филоподиумом или сплющивающимися и не будут смещаться с поверхности при осторожном постукивании или перемещении луночной пластины.
- Отсадите среду, содержащую неприкрепленные клетки, из каждой лунки и добавьте 1 мл питательной среды. Для медикаментозного лечения на этом этапе следует добавить дополнительные реагенты в питательные среды.
- Культивируйте клетки в инкубаторе в течение 24 ч и проверьте слияние, чтобы определить, сформировалась ли хиральность.
заметка: Для большинства типов клеток рекомендуется конфлюенция выше 75%, а чрезмерная конфлюенция может повлиять на характеристику хиральности.
5. Коллекция изображений
- Зафиксируйте ячейки при слиянии.
- Удалите питательную среду из луночного планшета и промойте один раз PBS.
- Добавить 4% раствор параформальдегида, выдержать при комнатной температуре 15 мин, а затем 3 раза промыть PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если фиксация значительно изменяет морфологию клеток, рекомендуется провести визуализацию перед фиксацией
- Используйте фазово-контрастный микроскоп с функционалом камеры, визуализируйте каждое кольцо на предметных стеклах с высоким разрешением (для анализа достаточно 10-кратного объектива объекта).
6. Характеристика хиральности клеток (Рисунок 2)
- Загрузите файлы кода MATLAB для определения характеристик хиральности.
- Добавьте папку с кодом и подпапки (с набором инструментов круговой статистики внутри) в путь MATLAB и откройте файл "ROI_selection.m". В строке 4 измените директорию на нужную папку с данными (для пользователей окна переключите "/" на "\" в строках 4 и 5).
- Измените размер изображения в строке 14, где первые две цифры представляют размер внутреннего круга кольца, а две другие представляют внешний.
заметка: Убедитесь, что размеры всех изображений в анализируемой папке идентичны.
- Нажмите кнопку «Выполнить», чтобы выполнить код MATLAB «ROI_selection.m» для определения области интереса (ROI) на фазово-контрастных изображениях.
- Вручную перетащите выделенный квадрат по размеру кольца, затем дважды щелкните по изображению, чтобы подтвердить выбор.
- Повторите этот шаг для каждого изображения в папке (следующее изображение автоматически появится после подтверждения выбора ROI предыдущего изображения); будет сгенерирован файл ".mat" для хранения информации о ROI для каждого изображения.
- Откройте файл "Analysis_batch.m" и измените директорию папки так же, как на шаге 6.2. (Для пользователей окна, при первом использовании, переключите "/" на "\" в строках 5, 6, 124 и 130)
- Нажмите на кнопку «Выполнить», чтобы выполнить код «Analysis_batch.m» для определения хиральности нескольких клеточных кольцевых паттернов. Будет сгенерирован файл "datatoexcel.txt", содержащий круговую статистику для каждого кольца, а также количество колец по часовой стрелке, нехиральных и против часовой стрелки.
