Анализ поглощения внеклеточных везикул: метод визуализации и количественной оценки клеточного поглощения внеклеточных везикул с использованием метода 3D-флуоресцентной визуализации

Abstract

Источник: Kim, C. J., et al., Анализ поглощения внеклеточных везикул с помощью конфокального микроскопического визуализационного анализа. J. Vis. Exp. (2022).

В этом видео мы демонстрируем анализ для визуализации и количественной оценки клеточного поглощения внеклеточных везикул или ВВ. Этот анализ использует 3D-флуоресцентную визуализацию с использованием конфокального микроскопа и позволяет отличить внутренние ВВ от тех, которые прилипли к поверхности клетки.

Protocol

1. Выделение EV и маркировка на кристалле иммунофлуоресцентной EV

1. Сбор питательных сред для клеточных культур (МКМ) и предварительная обработка МКМ для выделения ВВ
   1. Засейте клетки PC3 при 30% конфлюенции в колбе для клеточных культур размером 75^см2. Позвольте контрольным клеткам вырасти до 90% конфлюенции (~48 ч) в стандартных средах и добавках, специфичных для клеточной линии.
      заметка: Чтобы предотвратить влияние компонентов, содержащих ВВ, на клеточное поглощение (например, фетальную бычью сыворотку), используйте истощенные экзосомами среды и добавки.
   2. Соберите урожай с КМК.
   3. Центрифугируйте КМК при давлении 1000 x g в течение 10 минут при комнатной температуре (RT) для гранулирования любых неприкрепленных элементов и крупного мусора, собранного с помощью среды. Перенесите надосадочную жидкость в новую коническую трубку.
   4. В новой пробирке центрифугируйте надосадочную жидкость при давлении 10 000 x g в течение 20 минут при 4 °C, чтобы удалить более мелкий мусор и апоптотические тела, оставшиеся в среде. Некоторые более крупные электромобили будут катиться. Переложите надосадочную жидкость в новую трубку.
   5. Профильтруйте надосадочную жидкость через гидрофильный мембранный шприцевой фильтр с содержанием поливинилиденфторида (PVDF) 0,45 мкм.
      заметка: Если вы не проводите обработку МНЛЗ для изоляции электромобиля немедленно, храните предварительно обработанный МНЛЗ при температуре -80 °C до тех пор, пока не будет выполнена изоляция. Если заморожено, ограничьте циклы замораживания-размораживания до одного.
2. Изоляция электромобиля от МКМ с помощью микрофлюидного устройства на основе нанофильтрации
   1. Если заморожено, полностью разморозьте МНЛЗ и вихрь в течение 30 с перед шагом 1.2.2.
   2. Введите 1 мл предварительно обработанной КМК (шаг 1.1) в камеру для образцов микрофлюидного устройства на основе нанофильтрации (см. Таблицу материалов).
      заметка: Следуйте стандартной процедуре работы микрофлюидного устройства на основе нанофильтрации.
   3. Вращайте со скоростью 3000 об/мин в течение 10 минут в настольной прядильной машине (см. Таблицу материалов) для работы микрофлюидного устройства.
      заметка: Если МКМ остается в камере для образцов после первого прогона, выполняйте дополнительные вращения до тех пор, пока весь КМК не опорожнится из камеры для образца.
   4. Удалите жидкость из камеры для отходов с помощью пипетирования и повторите шаги 1.2.1, 1.2.2 и 1.2.3 дважды<бр/> заметка: Всего для изоляции электромобиля будет обработано 3 мл МЛК.
   5. Введите 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) в пробоотборную камеру для промывки изолированных EV. Вращайтесь в настольной прядильной машине для работы с микрофлюидным устройством, как указано в шаге 1.2.3. Найдите чистые электромобили на мембране устройства.
      заметка: В частности, качество EV, выделенных из микрофлюидного устройства на основе нанофильтрации, было подтверждено и сравнено с традиционным методом UC с помощью просвечивающей электронной микроскопии (TEM), сканирующего электронного микроскопа (SEM), анализа отслеживания наночастиц (NTA), микроскопии структурированного освещения, иммуноферментного анализа и ПЦР в реальном времени в предыдущем исследовании.
3. Иммунофлуоресцентное мечение ВВ с помощью микрофлюидного устройства на основе нанофильтрации (Рисунок 1)
   1. Выберите антитело, специфичное для ВВ, в соответствии с целью анализа (см. Таблицу материалов).
      заметка: Некоторые антитела могут влиять на сайты связывания лигандов, специфичные для путей поглощения EV (т.е. эндоцитоз).
   2. Введите 1 мкг/мл EV-специфического антитела в элюирующее отверстие устройства, содержащего 100 мкл выделенных EV.
   3. Инкубировать в течение 1 ч в темноте при ЛТ на планшетном шейкере, чтобы обеспечить равномерное распределение антител по образцу.
   4. Приложите к отверстию для элюирования скотч. Введите 1 мл PBS в камеру для образца, чтобы вымыть остатки антител.
   5. Вращайте устройство со скоростью 3000 об/мин, пока камера для образцов не опустеет. Удалите жидкость из камеры отходов с помощью пипетирования. Введите 1 мл PBS в камеру для образцов.
      заметка: Электромобили с флуоресцентной маркировкой будут располагаться в мембранной камере.
   6. Пипеткой с флуоресцентной меткой EV (рис. 2) из мембранной камеры в янтарную трубку. Заблокируйте от света до использования.

2. Инкубация клеток с флуоресцентно мечеными EV для анализа

поглощения EV

1. Целевой посев клеток и культивирование на совместимых с клеточными культурами чашках.
   1. Засейте 1 x 10⁴ ячейки PC3 в микрослайдовый 8-луночный планшет (9,4 x 10,7 мм для каждой лунки) с 0,2 мл среды или 4 x 10⁴ ячейки PC3 в чашку диаметром 35 мм с 1 мл среды. Поместите клетки в совместимую с клеточными культурами чашку, состоящую из тонкого покровного стекла (толщина: 0,18 мм).
      заметка: Тонкое покровное стекло сводит к минимуму неблагоприятное рассеяние света.
   2. Дайте клеткам прилипнуть в течение ночи в оптимальных условиях клеточной культуры (37 °C, концентрация_CO2 5%, влажность 90%).
   3. Дважды промойте слипшиеся клетки средой, обедненной экзосомами (описано в шаге 1.1.1).
2. Инкубация клеток с помощью флуоресцентно меченных EV.
   1. Измерьте концентрацию флуоресцентно меченных ВВ (шаг 1.3.5) с помощью анализа отслеживания наночастиц (NTA, рисунок 3). Определите оптимальную концентрацию флуоресцентно меченых ВВ, которые должны быть добавлены к культивируемым клеткам (шаг 2.1.2).
   2. Разбавьте флуоресцентно меченные EV средой, обедненной экзосомами, чтобы достичь желаемой концентрации, измеренной на шаге 2.2.1. (т.е. 7,80 x 10⁹ EV (в значении NTA) в 200 мкл среды, обедненной экзосомами.)
   3. Добавьте разбавленные EV (шаг 2.2.2) в прилипшие целевые ячейки, приготовленные в 2.1.2. Инкубируйте в течение экспериментального времени (т.е. 4, 8 или 12 часов).
   4. Трижды промойте клетки средой, не содержащей экзосом, чтобы удалить любые неинтернализованные ВВ.
      заметка: Дополнительно: Элементы могут быть зафиксированы после промывки.
   5. Пометьте цитоплазму адгезивных клеток 1 мкг/мл CMTMR ((5-(and-6)-((((4-chloromethyl)benzoyl)amino) тетраметилродамина) (см. Таблицу материалов) и инкубируйте в оптимальных условиях для клеточной культуры (37 °C, 5% концентрация CO₂, 90% влажности).
      заметка: Красители клеточной площади должны флуоресцировать отдельно от меченых ВВ, чтобы помочь в определении пространственного положения (интернализованного или поверхностного) шипованных ВВ во время анализа поглощения ВВ.
   6. Дважды промойте меченые клетки средой, обедненной экзосомами, чтобы удалить остатки красителя. Добавляйте в клетки свежие среды, обедненные экзосомами, для подготовки к конфокальной визуализации живых клеток.

3. Конфокальная микроскопия

1. Для проведения визуализации живых клеток используйте инкубатор на сцене для поддержания оптимальных условий культивирования клеток (37 °C, концентрация CO₂ 5%, влажность 90%).
2. Поместите подготовленные клетки в инкубатор на сцене.
3. Задайте параметры визуализации на основе контрольных образцов.
   заметка: Рекомендуемые контрольные образцы включают: только флуоресцентно меченные ВВ, флуоресцентно меченые клетки, немеченые ВВ и немеченые клетки.
4. Определите глубину целевых ячеек и диапазон размера укладки в направлении z для получения 3D-конфокальных изображений.
   заметка: Толщина Z-стека составляет 1 мкм. Получение конфокального 3D-изображения длилось 2 минуты 34 секунды (получение каждого изображения в Z-плоскости заняло около 8 секунд; всего двадцать изображений Z-стека).
5. Установите для получения изображений несколько z-стекированных изображений как клеточно-специфичного красителя (т. е. красного), так и EV-специфичного красителя (т. е. зеленого) одновременно (рис. 4 и рис. 5A).

4. Обработка изображений

1. Используйте программное обеспечение для автоматической обработки изображений для анализа необработанных z-стекированных конфокальных изображений и определения поглощения EV ячейками (см. Таблицу материалов).
2. Установите пороговые параметры для флуоресцентного сигнала клеток и специфичных для EV красителей. Постройте виртуальные поверхности ячеек (рис. 5A, B).
   1. Чтобы построить виртуальные поверхности ячеек, нажмите кнопку Добавить новые поверхности.
   2. Выберите «Расчет кратчайшего расстояния» в качестве «Настройки алгоритма», чтобы использовать алгоритм, предоставленный программным обеспечением, затем нажмите «Далее: Исходный канал».
   3. Выберите Канал 2 - CMTMR в качестве "Исходного канала" в этом эксперименте.
   4. Выберите "Сглаживание" и введите соответствующее значение в поле "Детали поверхностей" для сглаживания поверхности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 0,57 мкм в этом эксперименте, так как 1 пиксель соответствует 0,57 мкм в необработанных данных визуализации.
   5. Выберите «Абсолютная интенсивность» в качестве «порогового».
   6. Чтобы автоматически установить порог для флуоресцентного изображения с помощью предоставленного алгоритма, нажмите Порог (Абсолютная интенсивность): Значение устанавливается автоматически.
   7. Выберите «Включить» как «Разделить соприкасающиеся объекты (выращивание региона)» и введите значение предполагаемого размера ячейки в «Диаметр исходных точек», 10,0 мкм в этом эксперименте. Затем нажмите Далее: Фильтровать начальные точки.
   8. Чтобы настроить виртуальные поверхности ячеек, нажмите кнопку + Добавить, затем выберите Качество в качестве "Тип фильтра." Установите пороговое значение соответствующего значения (210 в этом эксперименте) для нижнего предела при визуальном осмотре и максимальное значение (1485) для верхнего предела, затем нажмите кнопку Готово><. заметка: Визуальный осмотр означает, что исследователь может отличить клеточную область от необработанного флуоресцентного изображения.
   9. Далее, чтобы построить виртуальные точки электромобилей, нажмите кнопку Добавить новые точки.
   10. Выберите различные размеры пятна (растущий регион) и расчет кратчайшего расстояния в качестве «Настроек алгоритма», затем нажмите «Далее: Исходный канал».
   11. Выберите Канал 1 - Alexa Fluor 488 в качестве "Исходного канала" в этом эксперименте.
   12. Введите соответствующее значение в поле "Расчетный диаметр XY" для обнаружения пятна, 1 мкм в этом эксперименте. Затем нажмите Далее: Фильтровать пятна.
   13. Чтобы настроить виртуальные точки EV, нажмите кнопку + Добавить, выберите «Качество» в качестве «Типа фильтра» и установите «Нижний порог» при визуальном осмотре, 100 в этом эксперименте. Затем нажмите кнопку Далее: Тип точечной области.
   14. Выберите «Абсолютная интенсивность» в качестве «Тип точечных областей», затем нажмите «Далее: Точечные области».
   15. Для порога, области точек EV, введите соответствующее значение в "Region Threshold" при визуальном осмотре, 100 как "Region Threshold" в этом эксперименте.
       заметка: Визуальный осмотр означает, что исследователь может отличить область EV от необработанного флуоресцентного изображения.
   16. Выберите «Объем региона» в качестве «Диаметр от», затем нажмите «Готово».
3. Используйте предоставленные программным обеспечением алгоритмы для разделения сгруппированных пятен внутри построенной поверхности на шаге 4.2 (рис. 5C, i-iv).
   1. Нажмите на созданные Пятна, затем перейдите в Фильтры.
   2. Нажмите кнопку + Добавить, затем выберите Кратчайшее расстояние до поверхностей Поверхности = Поверхность 1 в качестве Типа фильтра, затем нажмите кнопку Дублировать выделение в новые точки. Нижний порог (-7,0 в данном эксперименте) для нижнего предела и соответствующее значение (-0,5) для верхнего предела.
      заметка: Установите верхний предел с расчетным радиусом пятен. В этом эксперименте расчетный диаметр пятен, т.е. точек EV, был установлен равным 1 мкм на шаге 4.2.11; Таким образом, верхняя граница может составлять 0,5.
4. Автоматический подсчет EV внутри ячеек
   заметка: Программное обеспечение будет автоматически подсчитывать количество EV внутри ячеек, указывая количество, усвоенное целевыми ячейками.
   1. Щелкните на выбранном параметре "Построенные точки 1" [Кратчайшее расстояние до поверхностей Поверхности = Поверхности 1 в диапазоне от -7.00 до -0.500].
   2. Перейдите в раздел "Статистика" и экспортируйте значение из раздела "Общее количество спотов"
      заметка: Предоставленные программным обеспечением алгоритмы автоматически вычислят количество и объем ячеек.
5. Определите выход поглощения EV за инкубационный период на основе вышерассчитанных значений (рис. 6).
   1. Чтобы получить количество ячеек, нажмите на построенные поверхности 1, затем перейдите в раздел "Статистика" и экспортируйте значение параметра "Общее количество поверхностей" из раздела "Общее".
   2. Перейдите в раздел «Детализированный» в «Статистику», чтобы экспортировать объем из раздела «Подробно».

Results

Рисунок 1: Схематическая иллюстрация выделения ВВ и маркировки на кристалле с использованием микрофлюидного устройства на основе нанофильтрации. (A) Выделение ВВ из КМК. (B) Иммунофлуоресцентное мечение электромобилей на кристалле. (В) Удаление несвязанных антител.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 античеловеческое антитело к CD63	Биолегенда	353038	Флуоресцентное конъюгированное антитело к EV на основе флуоресцентного красителя
Краситель CellTracker Orange CMTMR	Thermo Fisher Scientific	С2927	Реагент для флуоресцентного мечения живых клеток (цитоплазмы)
CFI Apo Lambda S 40XC WI	Компания Nikon	MRD77400	Объектив для конфокальной визуализации, NA=1,25
CFI Plan Apo VC 20X	Компания Nikon	MRD70200	Объектив для конфокальной визуализации, NA=0,75
Экзодиск	Лабспиннер Инк.	БЫВШИЙ-Д1001	Микрофлюидное устройство на основе нанофильтрации для изоляции электромобилей
ЭкзоДискавери	Лабспиннер Инк.	Экс-Р1001	Устройство управления для Exodisc
Обедненный экзосомами FBS	Thermo Fisher Scientific	A2720801	Питательные вещества питательных сред для сбора EV, полученных из клеточной линии PC3
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	ВВР	1500-500	Питательное вещество для культивирования клеток
Козий антимышиный IgG H&L предадсорбированный	АБКАМ	АБ7063	Мышиное антитело IgG для негативного контроля мечения ВВ
Ibidi США U ТАРЕЛКА μ-тарелка 35 мм	Там же	81156	Культуральная чашка для конфокальной визуализации
Имарис 9.7.1	Оксфорд Instruments	9.7.1	Программное обеспечение для последующей обработки изображений
Incubator System + газовый смеситель CO2/O2/N2	Инструмент Live Cell	ТУ-О-20	Инкубационная система для визуализации живых клеток
Фотоаппарат Nikon A1 HD25 / A1R HD25	Компания Nikon	NA	Камера для конфокальной визуализации
Микроскоп Nikon Eclipse Ti	Компания Nikon	NA	Инвертированный микроскоп для конфокальной визуализации
NIS-Elements AR 4.50.00	Компания Nikon	4.50.00	Программное обеспечение для обработки изображений для микроскопа Nikon
NTA, NanoSight NS500	Malvern Panalytical	НС500	Прибор для измерения концентрации электромобилей
ОриджинПро 2020	Лаборатория OriginLab	9.7.0.185	Программное обеспечение для построения графиков
Пенициллин-стрептомицин	Thermo Fisher Scientific	15140122	Антибиотики для культивирования клеток
РПМИ 1640	Thermo Fisher Scientific	21875034	Питательные среды для клеточных культур для культивирования клеточной линии PC3
SYTO RNASelect Зеленый флуоресцентный клеточный краситель - 5 мМ раствор в ДМСО	Thermo Fisher Scientific	С32703	Окрашивание РНК флуоресцентным красителем для маркировки EV