1. Выделение EV и маркировка на кристалле иммунофлуоресцентной EV
- Сбор питательных сред для клеточных культур (МКМ) и предварительная обработка МКМ для выделения ВВ
- Засейте клетки PC3 при 30% конфлюенции в колбе для клеточных культур размером 75см2. Позвольте контрольным клеткам вырасти до 90% конфлюенции (~48 ч) в стандартных средах и добавках, специфичных для клеточной линии.
заметка: Чтобы предотвратить влияние компонентов, содержащих ВВ, на клеточное поглощение (например, фетальную бычью сыворотку), используйте истощенные экзосомами среды и добавки.
- Соберите урожай с КМК.
- Центрифугируйте КМК при давлении 1000 x g в течение 10 минут при комнатной температуре (RT) для гранулирования любых неприкрепленных элементов и крупного мусора, собранного с помощью среды. Перенесите надосадочную жидкость в новую коническую трубку.
- В новой пробирке центрифугируйте надосадочную жидкость при давлении 10 000 x g в течение 20 минут при 4 °C, чтобы удалить более мелкий мусор и апоптотические тела, оставшиеся в среде. Некоторые более крупные электромобили будут катиться. Переложите надосадочную жидкость в новую трубку.
- Профильтруйте надосадочную жидкость через гидрофильный мембранный шприцевой фильтр с содержанием поливинилиденфторида (PVDF) 0,45 мкм.
заметка: Если вы не проводите обработку МНЛЗ для изоляции электромобиля немедленно, храните предварительно обработанный МНЛЗ при температуре -80 °C до тех пор, пока не будет выполнена изоляция. Если заморожено, ограничьте циклы замораживания-размораживания до одного.
- Изоляция электромобиля от МКМ с помощью микрофлюидного устройства на основе нанофильтрации
- Если заморожено, полностью разморозьте МНЛЗ и вихрь в течение 30 с перед шагом 1.2.2.
- Введите 1 мл предварительно обработанной КМК (шаг 1.1) в камеру для образцов микрофлюидного устройства на основе нанофильтрации (см. Таблицу материалов).
заметка: Следуйте стандартной процедуре работы микрофлюидного устройства на основе нанофильтрации.
- Вращайте со скоростью 3000 об/мин в течение 10 минут в настольной прядильной машине (см. Таблицу материалов) для работы микрофлюидного устройства.
заметка: Если МКМ остается в камере для образцов после первого прогона, выполняйте дополнительные вращения до тех пор, пока весь КМК не опорожнится из камеры для образца.
- Удалите жидкость из камеры для отходов с помощью пипетирования и повторите шаги 1.2.1, 1.2.2 и 1.2.3 дважды<бр/>
заметка: Всего для изоляции электромобиля будет обработано 3 мл МЛК.
- Введите 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) в пробоотборную камеру для промывки изолированных EV. Вращайтесь в настольной прядильной машине для работы с микрофлюидным устройством, как указано в шаге 1.2.3. Найдите чистые электромобили на мембране устройства.
заметка: В частности, качество EV, выделенных из микрофлюидного устройства на основе нанофильтрации, было подтверждено и сравнено с традиционным методом UC с помощью просвечивающей электронной микроскопии (TEM), сканирующего электронного микроскопа (SEM), анализа отслеживания наночастиц (NTA), микроскопии структурированного освещения, иммуноферментного анализа и ПЦР в реальном времени в предыдущем исследовании.
- Иммунофлуоресцентное мечение ВВ с помощью микрофлюидного устройства на основе нанофильтрации (Рисунок 1)
- Выберите антитело, специфичное для ВВ, в соответствии с целью анализа (см. Таблицу материалов).
заметка: Некоторые антитела могут влиять на сайты связывания лигандов, специфичные для путей поглощения EV (т.е. эндоцитоз).
- Введите 1 мкг/мл EV-специфического антитела в элюирующее отверстие устройства, содержащего 100 мкл выделенных EV.
- Инкубировать в течение 1 ч в темноте при ЛТ на планшетном шейкере, чтобы обеспечить равномерное распределение антител по образцу.
- Приложите к отверстию для элюирования скотч. Введите 1 мл PBS в камеру для образца, чтобы вымыть остатки антител.
- Вращайте устройство со скоростью 3000 об/мин, пока камера для образцов не опустеет. Удалите жидкость из камеры отходов с помощью пипетирования. Введите 1 мл PBS в камеру для образцов.
заметка: Электромобили с флуоресцентной маркировкой будут располагаться в мембранной камере.
- Пипеткой с флуоресцентной меткой EV (рис. 2) из мембранной камеры в янтарную трубку. Заблокируйте от света до использования.
2. Инкубация клеток с флуоресцентно мечеными EV для анализа
поглощения EV
- Целевой посев клеток и культивирование на совместимых с клеточными культурами чашках.
- Засейте 1 x 104 ячейки PC3 в микрослайдовый 8-луночный планшет (9,4 x 10,7 мм для каждой лунки) с 0,2 мл среды или 4 x 104 ячейки PC3 в чашку диаметром 35 мм с 1 мл среды. Поместите клетки в совместимую с клеточными культурами чашку, состоящую из тонкого покровного стекла (толщина: 0,18 мм).
заметка: Тонкое покровное стекло сводит к минимуму неблагоприятное рассеяние света.
- Дайте клеткам прилипнуть в течение ночи в оптимальных условиях клеточной культуры (37 °C, концентрацияCO2 5%, влажность 90%).
- Дважды промойте слипшиеся клетки средой, обедненной экзосомами (описано в шаге 1.1.1).
- Инкубация клеток с помощью флуоресцентно меченных EV.
- Измерьте концентрацию флуоресцентно меченных ВВ (шаг 1.3.5) с помощью анализа отслеживания наночастиц (NTA, рисунок 3). Определите оптимальную концентрацию флуоресцентно меченых ВВ, которые должны быть добавлены к культивируемым клеткам (шаг 2.1.2).
- Разбавьте флуоресцентно меченные EV средой, обедненной экзосомами, чтобы достичь желаемой концентрации, измеренной на шаге 2.2.1. (т.е. 7,80 x 109 EV (в значении NTA) в 200 мкл среды, обедненной экзосомами.)
- Добавьте разбавленные EV (шаг 2.2.2) в прилипшие целевые ячейки, приготовленные в 2.1.2. Инкубируйте в течение экспериментального времени (т.е. 4, 8 или 12 часов).
- Трижды промойте клетки средой, не содержащей экзосом, чтобы удалить любые неинтернализованные ВВ.
заметка: Дополнительно: Элементы могут быть зафиксированы после промывки.
- Пометьте цитоплазму адгезивных клеток 1 мкг/мл CMTMR ((5-(and-6)-((((4-chloromethyl)benzoyl)amino) тетраметилродамина) (см. Таблицу материалов) и инкубируйте в оптимальных условиях для клеточной культуры (37 °C, 5% концентрация CO2, 90% влажности).
заметка: Красители клеточной площади должны флуоресцировать отдельно от меченых ВВ, чтобы помочь в определении пространственного положения (интернализованного или поверхностного) шипованных ВВ во время анализа поглощения ВВ.
- Дважды промойте меченые клетки средой, обедненной экзосомами, чтобы удалить остатки красителя. Добавляйте в клетки свежие среды, обедненные экзосомами, для подготовки к конфокальной визуализации живых клеток.
3. Конфокальная микроскопия
- Для проведения визуализации живых клеток используйте инкубатор на сцене для поддержания оптимальных условий культивирования клеток (37 °C, концентрация CO2 5%, влажность 90%).
- Поместите подготовленные клетки в инкубатор на сцене.
- Задайте параметры визуализации на основе контрольных образцов.
заметка: Рекомендуемые контрольные образцы включают: только флуоресцентно меченные ВВ, флуоресцентно меченые клетки, немеченые ВВ и немеченые клетки.
- Определите глубину целевых ячеек и диапазон размера укладки в направлении z для получения 3D-конфокальных изображений.
заметка: Толщина Z-стека составляет 1 мкм. Получение конфокального 3D-изображения длилось 2 минуты 34 секунды (получение каждого изображения в Z-плоскости заняло около 8 секунд; всего двадцать изображений Z-стека).
- Установите для получения изображений несколько z-стекированных изображений как клеточно-специфичного красителя (т. е. красного), так и EV-специфичного красителя (т. е. зеленого) одновременно (рис. 4 и рис. 5A).
4. Обработка изображений
- Используйте программное обеспечение для автоматической обработки изображений для анализа необработанных z-стекированных конфокальных изображений и определения поглощения EV ячейками (см. Таблицу материалов).
- Установите пороговые параметры для флуоресцентного сигнала клеток и специфичных для EV красителей. Постройте виртуальные поверхности ячеек (рис. 5A, B).
- Чтобы построить виртуальные поверхности ячеек, нажмите кнопку Добавить новые поверхности.
- Выберите «Расчет кратчайшего расстояния» в качестве «Настройки алгоритма», чтобы использовать алгоритм, предоставленный программным обеспечением, затем нажмите «Далее: Исходный канал».
- Выберите Канал 2 - CMTMR в качестве "Исходного канала" в этом эксперименте.
- Выберите "Сглаживание" и введите соответствующее значение в поле "Детали поверхностей" для сглаживания поверхности.
ПРИМЕЧАНИЕ: 0,57 мкм в этом эксперименте, так как 1 пиксель соответствует 0,57 мкм в необработанных данных визуализации.
- Выберите «Абсолютная интенсивность» в качестве «порогового».
- Чтобы автоматически установить порог для флуоресцентного изображения с помощью предоставленного алгоритма, нажмите Порог (Абсолютная интенсивность): Значение устанавливается автоматически.
- Выберите «Включить» как «Разделить соприкасающиеся объекты (выращивание региона)» и введите значение предполагаемого размера ячейки в «Диаметр исходных точек», 10,0 мкм в этом эксперименте. Затем нажмите Далее: Фильтровать начальные точки.
- Чтобы настроить виртуальные поверхности ячеек, нажмите кнопку + Добавить, затем выберите Качество в качестве "Тип фильтра." Установите пороговое значение соответствующего значения (210 в этом эксперименте) для нижнего предела при визуальном осмотре и максимальное значение (1485) для верхнего предела, затем нажмите кнопку Готово><.
заметка: Визуальный осмотр означает, что исследователь может отличить клеточную область от необработанного флуоресцентного изображения.
- Далее, чтобы построить виртуальные точки электромобилей, нажмите кнопку Добавить новые точки.
- Выберите различные размеры пятна (растущий регион) и расчет кратчайшего расстояния в качестве «Настроек алгоритма», затем нажмите «Далее: Исходный канал».
- Выберите Канал 1 - Alexa Fluor 488 в качестве "Исходного канала" в этом эксперименте.
- Введите соответствующее значение в поле "Расчетный диаметр XY" для обнаружения пятна, 1 мкм в этом эксперименте. Затем нажмите Далее: Фильтровать пятна.
- Чтобы настроить виртуальные точки EV, нажмите кнопку + Добавить, выберите «Качество» в качестве «Типа фильтра» и установите «Нижний порог» при визуальном осмотре, 100 в этом эксперименте. Затем нажмите кнопку Далее: Тип точечной области.
- Выберите «Абсолютная интенсивность» в качестве «Тип точечных областей», затем нажмите «Далее: Точечные области».
- Для порога, области точек EV, введите соответствующее значение в "Region Threshold" при визуальном осмотре, 100 как "Region Threshold" в этом эксперименте.
заметка: Визуальный осмотр означает, что исследователь может отличить область EV от необработанного флуоресцентного изображения.
- Выберите «Объем региона» в качестве «Диаметр от», затем нажмите «Готово».
- Используйте предоставленные программным обеспечением алгоритмы для разделения сгруппированных пятен внутри построенной поверхности на шаге 4.2 (рис. 5C, i-iv).
- Нажмите на созданные Пятна, затем перейдите в Фильтры.
- Нажмите кнопку + Добавить, затем выберите Кратчайшее расстояние до поверхностей Поверхности = Поверхность 1 в качестве Типа фильтра, затем нажмите кнопку Дублировать выделение в новые точки. Нижний порог (-7,0 в данном эксперименте) для нижнего предела и соответствующее значение (-0,5) для верхнего предела.
заметка: Установите верхний предел с расчетным радиусом пятен. В этом эксперименте расчетный диаметр пятен, т.е. точек EV, был установлен равным 1 мкм на шаге 4.2.11; Таким образом, верхняя граница может составлять 0,5.
- Автоматический подсчет EV внутри ячеек
заметка: Программное обеспечение будет автоматически подсчитывать количество EV внутри ячеек, указывая количество, усвоенное целевыми ячейками.
- Щелкните на выбранном параметре "Построенные точки 1" [Кратчайшее расстояние до поверхностей Поверхности = Поверхности 1 в диапазоне от -7.00 до -0.500].
- Перейдите в раздел "Статистика" и экспортируйте значение из раздела "Общее количество спотов"
заметка: Предоставленные программным обеспечением алгоритмы автоматически вычислят количество и объем ячеек.
- Определите выход поглощения EV за инкубационный период на основе вышерассчитанных значений (рис. 6).
- Чтобы получить количество ячеек, нажмите на построенные поверхности 1, затем перейдите в раздел "Статистика" и экспортируйте значение параметра "Общее количество поверхностей" из раздела "Общее".
- Перейдите в раздел «Детализированный» в «Статистику», чтобы экспортировать объем из раздела «Подробно».
