Анализ захвата вирусоподобных частиц: метод выделения антиген-отображающих VLP из образца с помощью магнитных шариков, сопряженных с нейтрализующими антителами

Аннотация

Источник: Rosengarten, J. F., et al. Обнаружение чувствительных к нейтрализации эпитопов в антигенах, отображаемых на вакцинах на основе вирусоподобных частиц (VLP), с помощью анализа захвата. J. Vis. Exp. (2022).

В этом видео мы демонстрируем иммунопреципитационный анализ, называемый анализом захвата VLP, для выделения антиген-отображающих вирусоподобных частиц (VLP) из образца. Антиген связывается со специфическими антителами, связанными с магнитными шариками, образуя иммобилизованный комплекс антиген-антитело, который затем отделяется и сохраняется для дальнейшего анализа.

Протокол

1. Подготовка образцов

1. Посев суспензионных клеточных линий VLP, полученных из 293-F-клеток, экспрессирующих структурные гены ВИЧ, затыкают рот отдельно или совместно с env при низкой плотности клеток 0,5 x 10⁶ клеток на мл в среде экспрессии 293-F.
2. Дайте им расшириться в течение 3-4 дней при 37 °C и 8%_CO2 при вращении шейкера инкубатора с орбитой 5 см и 135 оборотов в минуту (об/мин).
3. Гранулируйте клетки-продуценты центрифугированием при 100 x g в течение 5 мин. Отфильтруйте осветленную надосадочную жидкость для удаления остаточных клеток и клеточного мусора с помощью мембранных шприцевых фильтров 0,45 мкм из поливинилиденфторида (PVDF) для получения супернатанта бесклеточной культуры клеток (CFSN).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить. CFSN можно хранить в течение ночи при температуре 4 °C.
4. Либо используйте CFSN непосредственно для эксперимента, либо гранулируйте VLP из 35 мл CFSN с использованием ультрацентрифугирования (112 700 x g, 4 °C, 1,5 ч).
5. После ультрацентрифугирования выбросьте надосадочную жидкость и суспендируйте гранулы VLP в 200 мкл 15% (мас./об.) раствора трегалозы на пробирку центрифуги.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула VLP часто не видна невооруженным глазом. Протокол можно поставить на паузу здесь. VLP можно хранить при температуре –80 °C.
6. Перед анализом захвата VLP определите концентрацию белка вирусного ядра в образцах, содержащих VLP, с помощью иммуноферментного анализа. Этот шаг важен для стандартизации входных данных пробирного анализа.

2. Анализ захвата VLP

ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор рабочего процесса представлен на рисунке 1.

1. Суспензируйте магнитные шарики, пипетируя вверх и вниз или перемешивая на ротаторе со скоростью 50 об/мин в течение не менее 5 минут.
2. Тем временем приготовьте раствор антитела, содержащий bNAbs. Используйте 10 мкг каждого bNAb в 200 мкл буфера для связывания антител и промывки (см. Таблицу материалов) на одну реакцию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество антител может варьироваться в зависимости от аффинности bNAb и плотности украшения антигена на используемых VLP.
3. Используйте 50 мкл раствора магнитных шариков (см. Таблицу материалов) на одну реакцию и перенесите шарики в реакционную пробирку объемом 1,5 мл. Поместите пробирки на магнитную разделительную решетку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, для каждой трубки можно использовать сильный одиночный магнит, чтобы отделить шарики от надосадочной жидкости.
4. Подождите несколько минут, пока бусины соберутся у стенки трубки, чтобы убедиться, что все бусины собраны. Удалите надосадочную жидкость.
5. Снимите магнит и суспензируйте шарики в 200 мкл раствора bNAb, приготовленного на шаге 2.2. Инкубировать в течение от 30 минут до 3 часов, перемешивая на ротаторе при 50 об/мин при комнатной температуре.
6. Снова поместите реакционные пробирки в штатив для магнитной сепарации, подождите и удалите надосадочную жидкость.
7. Снимите трубки с магнита и промойте шарики, повторно суспендируя в 200 мкл связывающего антитела и промывочного буфера.
8. Повторите шаг 2.4. Удалите как можно больше буфера для стирки.
9. Добавьте образцы в связанный бусинами bNAbs.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вход VLP для анализа захвата с использованием частиц, полученных из ВИЧ, должен составлять не менее 15 нг белка вирусного ядра на реакцию. Количество VLP может варьироваться в зависимости от сродства bNAb и плотности декорирования антигена на используемых VLP.
10. Если объем образца, добавленного на шаге 2.9, меньше 1 мл, добавьте PBS, чтобы отрегулировать объем образца до 1 мл. Аккуратно подвесьте бусины с помощью пипетирования.
11. Инкубируйте образцы и шарики в течение 2,5 ч на ротаторе при комнатной температуре. Следите за тем, чтобы шарики оставались во взвешенном состоянии и раствор тщательно перемешивался во время инкубации.
12. Поместите трубки на магнит и удалите надосадочную жидкость.
13. Промойте магнитные шарики, суспензив их в 200 мкл промывочного буфера (см. Таблицу материалов). Повторите этап стирки три раза.
14. Суспензируйте шарики в 100 μл промывочного буфера и перенесите суспензию в чистую (термостойкую) реакционную трубку.
15. Поместите пробирку на штатив для магнитной сепарации (см. Таблицу материалов) и полностью удалите надосадочную жидкость.
16. Подготовьте денатурированные образцы SDS-PAGE в соответствии с шагами 2.16.1-2.16.2 или неденатурированные образцы путем элюирования VLP из магнитных шариков в соответствии с шагами 2.16.3-2.16.5.
    1. Для получения денатурированных образцов SDS-PAGE суспендировать гранулы в 20-80 мкл буфера Laemmli (0,8 мкл буфера Laemmli на 1 нг входного анализа p55 Gag) и инкубировать при 95 °C в течение 5 мин.
    2. Действуйте непосредственно с помощью SDS-PAGE или храните образцы при температуре -20 °C.
       ВНИМАНИЕ: Буфер Laemmli содержит 2-меркаптоэтанол и додецилсульфат натрия. Надевайте защитные перчатки и средства защиты глаз. Избегайте контакта с кожей, глазами и одеждой. Не вдыхайте пары. Работайте в хорошо проветриваемом помещении, например, в вытяжном шкафу.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить.
    3. В качестве альтернативы можно провести стадию неденатурирующего элюирования для получения VLP с сохраненной нативной структурой белка.
    4. Добавьте 25 μл элюирующего буфера (часто поставляемого с шариками) в магнитные шарики и инкубируйте в течение 2-5 минут при комнатной температуре.
    5. Удалите бусины и переложите элюат в чистую пробирку. Используйте элюат для последующих анализов или храните его при температуре 4 °C.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить.

Результаты

Рисунок 1: Схематическое изображение ключевых этапов анализа захвата VLP с использованием бесклеточных надосадочных линий. (1) Анализ захвата VLP начинается со связывания bNAbs ВИЧ-1 с магнитными шариками, связанными с белком G. Тем временем готовится раствор VLP с определенной концентрацией p55. Бесклеточный супернатант культур состоит из смеси p55 Gag VLP, белков клетки-хозяина и н...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Реакционные пробирки объемом 1,5 мл	Эппендорф
10x PBS	ГИБКО	70011044
Антитела (bnAb)	Полимун Сайентик
Белок Dynabeads G Набор для иммунопреципитации	invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	10007Д	В комплекте буферы и промывочные Решения
Элементы FreeStyle 293-F	invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	Р790-07
FreeStyle 293 Экспрессия Медиум	invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	12338026
Штатив для магнитной сепарации	Биолаборатории Новой Англии	С1509С	для 12 x 1,5 мл или 6 x 1,5 мл
Ультрацентрифуга Optima XE-90	Бекман Коултер
Поливинилиденфторид (PVDF) шприцевые фильтры, 0,45 мкм	Карл Рот	КС89.1
Мембрана трансферная из ПВДФ, 0,45 мкм	Карл Рот	Т830.1
Быстрый титер ВИЧ p24 ИФА	Клеточные биолаборатории	ВПК-108-Н
вертушка	Гейдольф	РЕАКС2
Ротор SW28	Бекман Коултер
Термомиксер	Сел Медиа	основной
Трегалоза дигидрат	Карл Рот	8897.2
Ультрапрозрачные центрифужные пробирки	Бекман Коултер	344058