$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Новая конструкция камеры (Рисунок 1)
- Откройте новую двухкамерную пластину анализатора клеток. Отложите в сторону верхнюю камеру с электродами.
- С помощью фрезерного станка срежьте 2 мм-образных нижних лунок пластины анализатора клеток.
- Прикрепите мембрану из полиэфирсульфона (PES) размером 2 см x 7 см с размером пор 0,2 мкм к дну выбритых лунок с помощью УФ-клея. Подождите 30 минут на отверждение, чтобы клей полностью застыл и инертен.
- С помощью фрезерного станка вырежьте две продольные прорези (1,5 мм x 5,6 мм) по бокам, чтобы защелкнуть их в выступах только что изготовленной третьей камеры.
- С помощью фрезерного станка создайте третью поликарбонатную камеру, которая повторяет габаритные размеры пластины анализатора клеток: 72 мм x 18 мм (Таблица материалов).
- Создание лунок глубиной 4,8 мм и диаметром 4,75 мм для имитации 16-луночной конструкции пластины клеточного анализатора. Это позволяет использовать 90 μл объема на лунку.
- По бокам создайте два треугольных гребня так, чтобы патронник запирался в исходные щели, созданные на шаге 1.4. Горизонтальная часть треугольника — 1,5 мм, вертикальная — 1,4 мм, гипотенуза — 2,052 мм.
- Создайте ручку на короткой стороне диаметром 50,8 мм и высотой 1,397 мм, чтобы она поместилась в вырез оригинальной пластины (Рисунок 1, Посередине).
- Используйте резиновую шайбу толщиной 0,9 мм для каждой лунки, чтобы обеспечить герметичное прилегание.
2. Клеточная культура (MDA-MB-231, DCIS, DCIS-Δ4, J2-фибробласты)
- Промойте адгезивные клеточные культуры (~70% конфлюенции) 1x фосфатно-солевым буфером (PBS).
- Добавьте 0,05% раствор трипсина-ЭДТА, чтобы снять клетки.
- Нейтрализуйте раствор трипсина питательной средой для клеточных культур, содержащей сыворотку, и подсчитайте клетки><, используя аликвоту клеточной суспензии.
заметка: Конкретные среды для культивирования клеток можно найти в таблице 1.
3. Диссоциация ксенотрансплантата, полученная от пациента
- Свежий кусочек опухоли (1 см2) измельчить в мелкую кашицу с помощью стерильного скальпеля.
- Поместите в коническую пробирку объемом 50 мл с 20 мл среды DMEM F12 с добавлением 3 мг/мл трипсина и 2 мг/мл коллагеназы.
- Инкубировать в термошейке (150 об/мин) при температуре 37°C в течение 20 минут.
- Вращайте трубку при давлении 500 x g в течение 5 минут; удалите надосадочную жидкость.
- Добавьте 20 μL DMEM F12 + 2% FBS для промывания клеток; отжимайте при 300 x g в течение 5 минут и удалите надосадочную жидкость. Повторите стирку еще два раза.
- Повторно суспендируйте в 1 мл среды PDX (Таблица 1) для подсчета клеток.
4. Извлечение клеток костного мозга
- Промойте фильтр для сбора костного мозга (КМ) 25 мл 1x PBS.
заметка: В этом исследовании PBS был добавлен к использованному фильтру для сбора КМ из больницы для сбора оставшейся КМ в фильтре.
- Медленно добавьте промытый BM в коническую пробирку объемом 50 мл с 25 мл градиентной среды, стараясь держать слои как можно более разделенными.
- Вращайте при 800 x g в течение 20 минут при 18 °C.
- После центрифугирования откачайте верхние слои (жир/плазма) и перенесите 5 мл белого слоя над средой с градиентом плотности, в которой находятся клетки BM, в коническую пробирку объемом 15 мл><.
заметка: В качестве альтернативы опустите пипетку объемом 5 мл в верхний слой до тех пор, пока она не коснется среднего слоя (BM), и очень медленно вынимайте пипетку из среднего слоя, не перемещая пипетку.
- Наполните коническую пробирку объемом 15 мл 1x PBS (~10 мл) и вращайте при 300 x g в течение 15 минут.
- Удалите надосадочную жидкость, оставшаяся белая гранула – это БМ.
- Если в грануле наблюдаются эритроциты, добавьте 5 мл раствора лизиса эритроцитов (Таблица материалов) и оставьте на 5 минут при комнатной температуре (RT). Вращайте при 300 x g в течение 5 минут и удалите надосадочную жидкость.
- Добавьте 10 мл 1x PBS для промывания клеток, вращайте при 300 x g в течение 5 минут и удалите надосадочную жидкость. Повторяйте лизис эритроцитов (шаг 4.7) до тех пор, пока гранула не станет белой.
5. Посев и сборка клеток
- Поместите все три стерильные камеры в колпак для культуры тканей.
- Расположите ручку на короткой стороне нижней камеры. Ориентируйте нижнюю камеру так, чтобы ручка была обращена к экспериментатору.
- Добавьте 30 000-50 000 ячеек в 90 мкл среды в каждую лунку нижней камеры. Избегайте образования пузырей. Это стромальные клетки, которые будут обеспечивать секретируемые факторы, но не будут обнаружены электродами верхней камеры.
- Используйте 5% среду с добавлением фетальной бычьей сыворотки в двух нижних лунках камеры для положительного контроля подвижности клеток. Используйте 0% сыворотку в качестве отрицательного контроля.
- Дайте нижней камере с ячейками постоять 10-15 минут в колпаке для отстаивания.
заметка: Этот шаг рекомендуется, если клетки адгезивы или растут во взвешенном состоянии.
- Поверните нижнюю камеру на 90° и поместите среднюю камеру сверху так, чтобы ручка на нижней камере скользнула в выемку на средней камере.
заметка: Ручка на нижней камере и синяя точка на средней камере находятся на противоположных концах сборки.
- Надавите вертикально вниз до тех пор, пока с каждой из длинных сторон сборки не раздастся щелчок.
- Добавьте 160 мкл среды, не содержащей сыворотки, во все лунки средней камеры.
- Убедитесь, что после заполнения лунок виден куполообразный мениск, в противном случае отрегулируйте окончательный объем на основе калибровки пипетки. Избегайте образования пузырей.
- Поместите верхнюю камеру электродами вниз на среднюю камеру, обязательно совместив синие точки на средней и верхней камерах.
- Надавите вертикально вниз до тех пор, пока с каждой из длинных сторон сборки не раздастся щелчок.
- Добавьте в верхнюю камеру 25-50 мкл среды, не содержащей сыворотки.
- Установите узел на клеточный анализатор двойного назначения в инкубатор для тканевых культур и подождите 30 минут, прежде чем измерять фон.
заметка: Это время необходимо для балансировки массива и может быть использовано для подготовки клеточных линий, которые будут добавлены в верхнюю камеру.
- Измерьте фон (см. раздел 6) и поместите сборку обратно в колпак для культуры тканей.
- Добавьте 30 000-50 000 клеток в 100 мкл бессывороточной среды в каждую лунку верхней камеры. Это те элементы, которые электрод обнаружит после их успешной миграции через мембрану
заметка: Для достижения максимального ответа рекомендуется выращивать клетки в бессывороточных средах или средах с низким содержанием сыворотки в течение 6-18 ч перед проведением анализа.
- Дайте узлу постоять в колпаке в течение 30 минут перед установкой на анализатор ячеек двойного назначения для измерения импеданса.
6. Измерение фона и импеданса
- Поместите массив в подставку прибора для анализа клеток двойного назначения.
- Откройте программное обеспечение для анализа клеток и выберите базу, которую вы будете использовать.
- Перейдите на вкладку «Сообщение» и убедитесь, что на ней написано «Подключения в порядке», чтобы убедиться, что массив правильно размещен в подставке и электроды хорошо выровнены с датчиками.
- Перейдите на вкладку «Заметки об эксперименте» и введите как можно больше информации об эксперименте.
- Перейдите на вкладку Макет и заполните описание макета массива.
- Перейдите на вкладку «Расписание» и добавьте два шага из меню «Шаги»: фоновый этап (один развертка) и тестовый шаг со 100 развертками — развертка каждые 15 минут, всего 25 часов.
- После того, как матрица пробудет в инкубаторе клеточного анализатора двойного назначения в течение 30 минут, нажмите кнопку «Воспроизвести», чтобы начать фоновое измерение. Появится окно с просьбой выбрать папку для сохранения данных.
- После завершения фонового измерения извлеките матрицу из подставки и поместите ее обратно в колпак для клеточных культур.
- Добавьте клетки в верхнюю камеру, как описано в шаге 5.13, и подержите сборку в колпаке для культуры тканей в течение 30 минут, чтобы клетки осели.
- Поместите массив обратно в анализатор клеток двойного назначения и проверьте вкладку Сообщение для сообщения Connections OK.
- Нажмите кнопку «Воспроизвести», чтобы начать измерение импеданса.
- Нажмите на вкладку Plot, чтобы отслеживать ход сигнала.
- Если конечная точка достигнута до истечения 25 часов, нажмите на шаг «Отмена» в раскрывающемся меню «Выполнить».
- Чтобы экспортировать данные, щелкните правой кнопкой мыши на графике, выберите «Копировать» в формате списка, а затем вставьте данные в таблицу.
заметка: Данные могут быть экспортированы в виде индекса ячейки или индекса дельта-ячейки. Для экспорта также можно выбрать информацию о графике и/или компоновке.
Таблица 1: Состав среды для клеточных культур. В таблице перечислены составы сред MDA-MD-231, сред J2 Fibroblasts, сред DCIS и сред PDX.
| медиа | Составляющих | Концентрация/пропорция |
| Медиа MDA-MD-231 | DMEM | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | 10% |
| J2 Фильтрующие среды для фибробластов | DMEM | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | 10% |
| Медиа DCIS | ДМЕМ Ф12 | |
| Лошадиная сыворотка (HS) | 5% |
| Эпидермальный фактор роста (EGF) | 20 нг/мл |
| инсулин | 10 мкг/мл |
| гидрокортизон | 0,5 мкг/мл |
| Холерный токсин | 100 нг/мл |
| Медиа PDX | ДМЕМ Ф12 | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | 2% |
| ХЕПЕС | 1 М |
| Инсулин трансферрин селен этаноламин (ITS) | 10 мкг/мл |
| гидрокортизон | 0,5 мкг/мл |
| Бычий сывороточный альбумин (BSA) | 1 мг/мл |
