Анализ активности цитратсинтазы: колориметрический анализ для измерения активности митохондриальной цитратсинтазы в гомогенате тканей дрозофилы

Аннотация

Источник: Wei, P., et al., Колориметрический анализ активности цитратсинтазы у Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2020)

Это видео описывает колориметрический анализ для измерения активности митохондриальной цитратсинтазы, присутствующей в тканевом гомогенате дрозофилы.

Протокол

1. Колориметрический анализ активности цитратсинтазы для D. melanogaster

1. Соберите по десять взрослых мух на каждый образец. Соберите не менее трех образцов для каждого генотипа.
2. Приготовьте 500 мкл ледяного экстракционного буфера, содержащего 20 мМ HEPES (pH = 7,2), 1 мМ ЭДТА и 0,1% тритона X-100 в пробирке объемом 1,5 мл для каждого образца.
3. Обезболите взрослых мух с_СО2 на наркозной салфетке и изолируйте нужные ткани. Чтобы изолировать грудную клетку взрослой мухи, например, зафиксируйте грудную клетку мухи парой щипцов, а затем изолируйте брюшную полость мухи, разрезав по границе грудной клетки и брюшка с помощью ножниц. Соберите грудную клетку мухи для анализа активности цитратсинтазы мышц.
   заметка: Определяют свежий вес ткани на этом этапе, если используют ее для нормализации активности цитратсинтазы.
4. Немедленно переложите 10 грудных клеток взрослых мух в 100 μл ледяного экстракционного буфера и гомогенизируйте пестиком на льду. Чтобы образцы оставались холодными, гомогенизируйте образцы в течение 5-10 секунд на льду, затем оставьте образцы на льду в течение 5 секунд и повторяйте до тех пор, пока все ткани в пробирке не будут полностью гомогенизированы><. заметка: Обмотайте трубку лентой, проверьте гомогенаты, чтобы убедиться в отсутствии сгустков в гомогенатах и в том, что ткани в трубке полностью гомогенизированы. Все обработки образцов должны проводиться на льду.
5. Возьмите по 10 мкл каждого гомогенизированного образца в новую пробирку для измерения содержания белка. Храните образцы для измерения белка на льду.
   заметка: Образцы белка можно замораживать и хранить при температуре -80 °C для последующего анализа. Концентрации белков служат внутренним параметром для нормализации активности цитратсинтазы.
6. Добавьте 400 μL ледяного экстракционного буфера в каждый оставшийся образец, чтобы общий объем составил 500 μL. Хорошо перемешайте, осторожно пипетируя вверх и вниз не менее 5 раз, избегая образования пузырьков. Для каждой реакции добавляют 1 мкл разбавленного клеточного лизата к 150 мкл свежеприготовленного реакционного раствора (20 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 мМ DTNB, 0,3 мМ ацетил КоА, 1 мМ щавелеуксусной кислоты). Тщательно и немедленно перемешайте с помощью осторожного пипетирования, не допуская образования пузырьков. Измеряйте поглощение при длине волны 412 нм каждые 10-30 с в течение 4 минут при 25°C с помощью планшетного считывателя, способного измерять поглощение на длине волны 412 нм с минимальными интервалами 10 с.<бр/> заметка: Меняйте наконечник перед пипетированием другого реагента и избегайте образования пузырьков в лунках. Неполное смешивание реагентов может привести к отклонениям в измерениях. Анализ активности цитратсинтазы следует проводить при комнатной температуре сразу после сбора образцов, так как этот анализ используется для количественного определения интактной митохондриальной массы. Реакционный буфер следует готовить непосредственно перед использованием и не следует хранить.
7. Отображайте данные как оптическая плотность (OD), поглощение (abs) (ось Y) в зависимости от времени (в минутах) (ось X). Затем рассчитайте наклон для линейной части кривой, где скорость реакции равна
   
   Разделите значение на концентрацию белка образца для нормализации активности цитратсинтазы. Активность цитратсинтазы рассчитывается как
   
   заметка: Концентрацию белка в образце можно измерить с помощью набора для анализа концентрации белка.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил]этансульфоновая кислота (HEPES)	Сигма-Олдрич	V900477
2-амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиол (основание ТРИЗМА)	Сигма-Олдрич	V900483
Ацетил-КоА	Сигма-Олдрич	А2181
Дитио-бис-нитробензойная кислота (DTNB)	Сигма-Олдрич	Д8130
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)	Сигма-Олдрич	V900106
Оксалоацетат	Сигма-Олдрич	О4126
Пеллетный пестик	Сангон	F619072
Мотор пеллетного пестика	Тяньген	OSE-Y10
Считыватель пластин	БиоТек	вечность
Набор для анализа белка BCA	Бейотим	П0010С
ножницы	ВПИ	14124
Тритон Х-100	Сангон	A110694-0100