Анализ защиты ферментов на основе лизостафина: метод in vitro для количественной оценки внутриклеточной нагрузки Staphylococcus aureus путем фермент-опосредованного селективного уничтожения внеклеточных бактерий

Аннотация

Источник: Rigaill, J. et al. Улучшенный анализ защиты ферментов для изучения интернализации золотистого стафилококка и внутриклеточной эффективности антимикробных соединений. J. Vis. Exp. (2021).

В этом видео мы демонстрируем анализ защиты фермента in vitro на основе лизостафина для количественной оценки интернализации золотистого стафилококка в клетках A549. Этот анализ помогает в качественных, количественных и характеризирующих исследованиях внутриклеточной бактериальной нагрузки в клетках-хозяевах.

Протокол

1. Инокуляция клеток

1. Начните с культивирования эпителиальных клеток человека A549 в модифицированной среде Dulbecco Eagle Medium (DMEM) с высоким содержанием глюкозы и феноловым красным, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) без антибиотиков.
2. Наблюдайте за каждой лункой 24-луночного планшета с помощью микроскопии с малым увеличением, чтобы убедиться, что эпителиальные клетки человека здоровы и растут должным образом.
3. Извлеките и выбросьте отработанную питательную среду для клеточных клеток с 24-луночного планшета.
4. Добавьте 500 мкл бактериальной суспензии золотистого стафилококка, приготовленной в DMEM без фенолового красного, для посева в каждую лунку со 100% сливающимися клетками.
5. Инкубировать клетки в течение 2 ч при 36 ± 1 °C и 5% CO₂,
   ПРИМЕЧАНИЕ: рекомендуется использовать три лунки планшета для каждого тестируемого условия (в трех экземплярах) и провести не менее трех независимых экспериментов. Задержка инкубации может быть адаптирована в соответствии с целью эксперимента.

2. Количественное определение внутриклеточных бактерий с улучшенным анализом защиты ферментов (iEPA)

1. Приготовьте 7 мл буфера для 4-кратного лизиса с 3,5 мл 2% Triton X-100 в стерильной воде и 3,5 мл трипсина-ЭДТА.
2. Приготовьте стоковый раствор лизостафина в концентрации 10 мг/мл в ацетатном буфере и аликвоту 25 мкл в криовиалах. Хранить при температуре -80 °C до 6 месяцев.
3. Приготовьте 250 мкл свежего рабочего раствора лизостафина в концентрации 1 мг/мл путем смешивания 25 мкл исходного раствора лизостафина (10 мг/мл) и 225 мкл 0,1 М Трис-HCl. Хранить при температуре 4 °C до 48 часов.
4. Приготовьте 6,25 мл среды для полной инфекции с добавлением лизостафина путем добавления 6 мл среды для полной инфекции к 250 мкл рабочего раствора лизостафина.
5. Добавьте в каждую лунку 250 μл полной инфекционной среды, обогащенной лизостафином, и осторожно перемешивайте планшет, поворачивая планшет вручную.
6. Инкубируйте клетки в течение 1 ч при 36 ± 1 °C при 5%_CO2, чтобы лизостафин убил внеклеточные бактерии.
7. В конце времени инкубации добавьте 10 мкл протеиназы К в концентрации 20 мг/мл в каждую лунку для инактивации лизостафина.
8. Инкубируйте клетки в течение 2 мин при комнатной температуре.
9. Добавьте 250 мкл 4-кратного буфера для лизиса для лизиса клеток методом осмотического шока.
10. Инкубируйте клетки в течение 10 минут при температуре 36 ± 1 °C.
11. Тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз десять раз по всему дну лунки, чтобы убедиться, что клетки полностью лизированы и гомогенизированы.
12. Используйте автоматический спиральный сплав для определения нагрузки S. aureus в каждой лунке.
13. Инкубировать агаровые планшеты в течение 18-24 ч при температуре 36 ± 1 °C.
14. На следующий день подсчитайте количество колоний с помощью счетчика колоний, чтобы рассчитать внутриклеточную нагрузку S. aureus каждой лунки.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
24-луночный планшет	КОРНИНГ-ФАЛЬКОН	353047
Клеточная линия A549	АТКС	ВКЛ-185
Ацетатный буферный раствор pH 4,6	Флюка	No 31048	Используется для приготовления исходного раствора лизостпахина в концентрации 10 мг/мл в 20 мМ ацетата натрия.
АМБИЦИН (Рекомбинантный лизостафин)	АМБИ	ЛСПН-50	Лиофилизированный рекоминантный лизостафин. Заморозьте при температуре -80 °C для длительного хранения.
COS - колумбийский агар + 5% овечьей крови	Биомерье	No 43049	Вместо него можно использовать любую агаровую пластину, подходящую для выращивания стафилококков.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, с высоким содержанием глюкозы и феноловым красным	Сигма-Олдрич	Д6429
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, с высоким содержанием глюкозы без фенола красного	Сигма-Олдрич	Д1145
Фосфатный буферный раствор Дульбекко	Сигма-Олдрич	Д8537
Дульбекко Фосфатно-буферный физиологический раствор с MgCl2 и CaCl2, стерильно-фильтрованный	Сигма-Олдрич	Д8662
Дульбекко Фосфатно-солевой буфер, стерильно отфильтрованный	Сигма-Олдрич	Д8537
Easyspiral разбавленный	Межнаука	414000	Автоматический разбавитель и спиральный пластинка
Фетальная бычья сыворотка	Gibco	10270-106
Протеиназа К, рекомбинантная 20 мг/мл	Евробио	GEXPRK01-В5	> 30 Ед/мг, лот 901727
Скан 4000	Межнаука	438000	Автоматический счетчик колоний
Стерильная вода	ОТЭС	600500
TC20 Автоматический счетчик ячеек	Биорад	1450102	Автоматический счетчик ячеек
Трис 1 м pH 8,0	Инвитроген	AM9855G	Используется для приготовления рабочего раствора лизостафина в концентрации 1 мг/мл в 0,1 М Трис-HCl.
Тритон Х-100	Сигма-Олдрич	Т8787
Трипсин - раствор ЭДТА	Сигма-Олдрич	Т3924	0,05% свиного трипсина и 0,02% ЭДТА в сбалансированном солевом растворе Хэнкса с феноловым красным
Широкопольный флуоресцентный микроскоп	Компания Nikon	Ti2