$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE
1. Приготовление раствора
ПРИМЕЧАНИЕ: Обрабатывайте и готовьте все реагенты и растворы с помощью стеклянной посуды без железа или одноразовой пластиковой посуды. Не допускайте контакта металлических лабораторных материалов (например, шпателей из нержавеющей стали) с какими-либо реагентами или растворами из-за риска загрязнения железом. Убедитесь, что любая многоразовая стеклянная посуда не содержит утюга. Постирайте материалы соответствующим лабораторным моющим средством в течение 30-60 минут, промойте деионизированной водой, замочите на ночь в 37% растворе азотной кислоты, разбавленном в соотношении 1:3 с деионизированной водой, снова промойте деионизированной водой и дайте высохнуть.
- Смесь кислот: Добавьте 10 г трихлоруксусной кислоты к 82,2 мл 37% соляной кислоты в стеклянной бутылке, тщательно растворите и доведите конечный объем до 100 мл с помощью деионизированной воды. Перед использованием встряхните. ><В качестве альтернативы используйте только 37% соляную кислоту для переваривания тканей.
заметка: Раствор стабилен не менее 2 месяцев при хранении во флаконах с реагентами темно-коричневого цвета.<бр/>
осторожность: Соляная кислота и трихлоруксусная кислота являются коррозионными, а концентрированные формы выделяют токсичные кислые пары. При работе с кислотами всегда надевайте защитную одежду, устойчивые к химическим веществам перчатки и защитные очки от химических веществ. Избегайте их вдыхания и всегда работайте с кислотами, находясь под вытяжным шкафом.
- Насыщенный ацетат натрия: Добавьте 228 г безводного ацетата натрия в 400 мл деионизированной воды в стеклянной бутылке и перемешайте в течение ночи при комнатной температуре. Дайте раствору отдохнуть и выпасть в осадок в течение суток. Если осадков не происходит, продолжайте добавлять небольшое количество ацетата натрия. Храните раствор в стеклянной бутылке.
- Хромогенный реагент: Для приготовления 1 мл хромогенного реагента добавьте 1 мг динатриевой соли 4,7-дифенил-1,10-фенантролиндисульфоновой кислоты в 500 мкл деионизированной воды и 10 мкл концентрированной (100%) тиогликолевой кислоты и тщательно растворите. Заключительный объем доведите до 1 мл с помощью деионизированной воды.<бр/>
заметка: Приготовьте столько хромогенного реактива, сколько необходимо. Раствор стабилен в течение 1 месяца при защите от света.
- Рабочий реагент хромоген (WCR): добавьте 1 объем реагента хромогена к 5 объемам насыщенного ацетата натрия и 5 объемам деионизированной воды><.
заметка: Этот раствор следует готовить свежим в день использования.
- Стандартный раствор для исходного железа: Чтобы приготовить стандартный раствор железа с массой 20 мМ, поместите 111,5 мг порошка карбонильного железа в объемную колбу объемом 250 мл, содержащую 5480 мкл 37% соляной кислоты. Оставьте растворяться на ночь при комнатной температуре (или выдержите на кипящей водяной бане). Затем доведите раствор до конечного объема 100 мл с деионизированной водой.
заметка: Стандартный раствор может храниться неограниченное время при хранении в плотно закрытой посуде.
- Стандартный раствор для рабочего железа (WISS): Добавьте 13,5 мкл 37% соляной кислоты на 500 мкл деионизированной воды. Добавьте 10 μL стандартного раствора Stock Iron Standard и доведите окончательный объем до 1 мл с деионизированной водой (11,169 μг Fe/мл, 200 μM; измерено с помощью AAS).
заметка: Рабочий раствор должен быть приготовлен свежим в день использования.
2. Сушка образца
- Разрежьте образец ткани весом 10-100 мг лезвием скальпеля. Точно взвесьте его на аналитических/прецизионных весах на небольшом кусочке парапленки (Fresh Weight).
- С помощью пластикового пинцета поместите кусок салфетки в 24-луночную пластину (без крышки для испарения воды) и дайте ему высохнуть в стандартном инкубаторе при температуре 65 °C в течение 48 часов.
- В качестве альтернативы можно использовать лабораторную микроволновую печь для разложения для сушки образцов тканей. С помощью пластикового пинцета поместите отвеяненный кусок салфетки в тефлоновую чашку без железа и высушите ее в микроволновой печи. Установите рабочие параметры в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора.
заметка: В качестве справки в таблице 1 приведены рабочие параметры сушки образцов печени с помощью специальной печи для варки (см. Таблицу материалов).
- С помощью пластикового пинцета поместите каждый высушенный кусочек ткани на небольшой кусочек парапленки внутри аналитических/прецизионных весов и точно взвесьте его (сухой вес).
3. Кислое разложение образца
- С помощью пластикового пинцета переложите каждый высушенный кусочек ткани в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
- Добавьте 1 мл кислотной смеси и закройте микроцентрифужную пробирку. Таким же образом приготовьте заготовку с кислотой, за исключением того, чтобы ткань была опущена.
осторожность: Кислотная смесь вызывает коррозию и выделяет токсичные пары. При работе с кислотной смесью надевайте защитную одежду, устойчивые к химическим веществам перчатки и защитные очки от химических веществ. Избегайте вдыхания и всегда держите его в руках, находясь под вытяжным шкафом.
- Расщепляйте ткани путем инкубации микроцентрифужных пробирок в инкубаторе при температуре 65 °C в течение 20 часов.
- После охлаждения до комнатной температуры перенесите 500 μL экстракта прозрачной (желтой) кислоты (надосадочной жидкости) в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с помощью микропипетки с пластиковыми наконечниками. Если не удается получить прозрачную надосадочную жидкость, проводят короткий отжим центрифугирования.
осторожность: Надосадочная жидкость обладает высокой кислотностью. При работе с надосадочной жидкостью надевайте защитную одежду, химически стойкие перчатки и защитные очки от химических брызг. Всегда держите их в руках, находясь под вытяжным шкафом.
заметка: На этом этапе кислотные экстракты можно сразу использовать для колориметрического анализа или замораживать при -20 °C для последующего использования. Полностью разморозьте замороженные образцы до комнатной температуры и оберните их перед использованием.
4. Развитие цвета
- Проводите хромогенные реакции, как указано в таблице 2, в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл или, для повышения производительности, непосредственно в плоскодонные, 96-луночные, прозрачные, необработанные микропланшеты из полистирола. Подготовьте все реакции (кислотный бланк, стандарт и образец) хотя бы в двух экземплярах.
- Выдерживать при комнатной температуре в течение 15 минут.
5. Чтение абсорбции
- Измерьте поглощение образца в спектрофотометре или планшетном ридере на длине волны 535 нм относительно эталона деионизированной воды. Таблички можно читать без крышки или с крышкой. В футляре с крышкой удалите конденсат, образовавшийся из-за выброса паров кислоты из крышки непосредственно перед измерением, чтобы избежать возможного вмешательства в показания абсорбции.
заметка: Оптическая абсорбция кислотной заготовки, считанной на фоне деионизированной воды (эталон), должна быть менее 0,015; Оптическое поглощение стандарта и образцов должно составлять от 0,100 до 1,000. Для образцов с очень высоким или очень низким содержанием железа может потребоваться корректировка объемов кислотного экстракта (надосадочной жидкости) и diH2O (Таблица 2): если абсорбция больше 1,0, используйте меньший объем образца (надосадочной жидкости); Когда абсорбция ниже 0,1, используйте больший объем надосадочной жидкости. Объем образца (Vsmp) учитывается при расчете содержания железа в каждой ткани образца (см. шаг 6).
6. Расчет содержания железа в тканях
- Рассчитайте содержание железа в негемовых тканях по следующему уравнению:
Тканевое железо (μг/г сухой ткани) = Уравнение 1
AT = поглощение испытуемого образца
AB = поглощение кислотного бланка
AS = поглощение стандарта<бр />
Fes = концентрация железа WISS (μг Fe/мл)
W = масса сухой ткани (г)
Vsmp = объем образца (переменный объем надосадочной жидкости в таблице 2, пересчитанный в мл)
Vf = конечный объем смеси кислот после ночной инкубации при 65 °C (соответствует объему кислоты плюс объем сухой ткани в мл; если вес образца существенно не отличается, примите постоянный объем ≈ 1 мл)
Vstd = стандартный объем железа (объем WISS в таблице 2 в пересчете на мл)
Vrv = конечный объем реакции (общий объем в таблице 2 в пересчете на мл)
Таблица 1: Рабочие параметры сушки печени в микроволновой печи для разложения, используемой здесь
| Мощность 650 Вт (%): | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
| Давление (PSI): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Время (мин): | 10 | 15 | 30 | 30 | 40 |
| Время при давлении (TAP): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| вентилятор: | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
Таблица 2: Приготовление реакций хромогена в пробирках объемом 1,5 мл или 96-луночных планшетах.
балла
балла
балла
балла
| | WCR (μл) | Кислотная смесь (μл) | Надосадочная жидкость (μл) | WISS (μл) | diH2O (μL) | Общий объем (μл) |
| 1.5 мл пробирки | Кислотная заготовка | 1000 | 150 | | | 150 | 1300 |
| стандарт | 1000 | 150 | | 150 | | 1300 |
| образец | 1000 | | переменная | | переменная | 1300 |
| 96-луночный микропланшет | Кислотная заготовка | 150 | 22,5 | | | 22,5 | 195 |
| стандарт | 150 | 22,5 | | 22,5 | | 195 |
| образец | 150 | | переменная | | переменная | 195 |