$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Расширение прародителей OC
- Ресуспендируйте PBMC в полном α-MEM (10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% амфотерицин B), содержащем 20 нг/мл M-CSF. Затравите PBMC плотностью 2,5 х 105 клеток/см2. Обычно клетки, выделенные из 15-20 мл свежей крови, могут быть посеяны в одну колбу размером 75 см2 (1,5-2 х 107 клеток).
- Кормите клетки свежим полным α-MEM, содержащим 20 нг/мл M-CSF, каждый третий день до тех пор, пока прикрепленные клетки не достигнут желаемого слияния. Типичный выход составляет 1,5-2 x 106 клеток/колба при слиянии клеток на 95%. Обычно период расширения длится 6 дней.
заметка: Остеокластогенный потенциал предшественников может снижаться при длительном культивировании.
2. Индукция остеокластогенеза в пластинах, покрытых фосфатом кальция
- Для облегчения адгезии клеток инкубируйте покрытые фосфатом кальция (CaP) пластины с 50 мкл FBS в течение 1 ч в инкубаторе при температуре 37 °C.
- Чтобы отделить прекурсоры ОК, дважды промойте колбу PBS, чтобы удалить мертвые или неадгезивные клетки. Добавьте 4 мл трипсина (Таблица материалов) на 75 см2 колбы, на 30 минут.
- Добавьте 4 мл полного α-MEM, чтобы остановить пищеварение, осторожно отделите клетки с помощью скребка для клеток и перенесите клетки в пробирку объемом 50 мл.
- Определите общее количество ячеек с помощью камеры Нейбауэра или аналогичной.
- Гранулируйте клетки центрифугированием в течение 7 мин при 350 x g. Повторно суспендируйте гранулу в достаточном количестве полного α-MEM, содержащего 20 нг/мл M-CSF и 20 нг/мл RANKL, чтобы получить концентрацию 1 x 106 клеток/мл.
- Аспират FBS раствора из 96-луночного планшета с покрытием CaP и пипетки 200 мкл клеточной суспензии на лунку (2 x 105 клеток/лунка).
- Инкубируйте прекурсоры OC в течение желаемого периода времени или с желаемыми реагентами, относящимися к экспериментальному плану. Как правило, большое количество крупных и многоядерных ОК можно наблюдать через 6 дней и при образовании резорбционных ямок. Скармливайте клетки свежей полной средой α-MEM, содержащей 20 нг/мл M-CSF и 20 нг/мл RANKL каждый третий день.
- В конце инкубации клетки дважды промыть PBS, зафиксировать 4% параформальдегидом в течение 10 мин и снова промыть PBS.
- Используйте фиксированные ОС непосредственно для флуоресцентного окрашивания или храните при температуре 4 °C.
3. Флуоресцентное окрашивание ОУ и покрытие фосфатом кальция
- Инкубировать фиксированные клетки с пермеабилизационным буфером (0,1% Тритона в PBS) в течение 5 мин.
- Окрашивание актиновых филаментов 100 мкл меченого раствора фаллоидина AlexaFluor 546 в PBS в течение 30 мин и аспирация окрашивающего раствора. Добавьте 100 μL раствора для окрашивания Hoechst 33342 (10 μг/мл в PBS) в течение 10 минут к окрашиванию ядер. Также можно использовать DAPI.
- Окрашивание CaP 100 μL 10 μМ кальцеина в PBS на 10 мин. Трижды промыть PBS и сделать снимки.