Использование радиоактивных материалов (RAM) требует предварительного одобрения назначенного комитета по безопасности в каждом учреждении.
1. Приготовление исходных растворов для подложек с 14С-меткой
- Приготовьте 4 мМ стокового раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА), смешав 11 г БСА и 33,1 мл фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS) и осторожно встряхивая при комнатной температуре в течение ~3 часов до полного растворения БСА. Перед использованием нагрейте стоковый раствор BSA на водяной бане при температуре 70 °C.
- Сушка на воздухе 50 μCi 14C-олеата (50 μCi/μмоль этанола) во флаконе с закрытой крышкой в течение 8 часов в специальном рабочем колпаке RAM. Добавьте 312,5 мкл H2O, а затем 3,5 мг (11,5 моль) олеата натрия. Тщательно перемешиваем.
- Полученный раствор подогреть до 70 °C на водяной бане. Добавьте 0,9375 мл предварительно подогретого стокового раствора БСА с получением 10 мМ горячего стоечного раствора олеата (содержащего соотношение 14С-олеата и немеченого олеата 1:11,5). Аквотируйте исходный раствор и храните его при температуре -20 °C для длительного использования.
- Используйте 14С-глюкозы и 14С-глютамина сразу после размораживания.
2. Приготовление среды, содержащей 14подложек, меченных С
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить надежную концентрацию энергетических субстратов в среде, необходимо использовать специально изготовленные среды со свежими субстратами, добавленными незадолго до использования. Здесь используется специально изготовленная минимальная незаменимая среда (MEMα) без глюкозы, пирувата, глутамина, фенолового красного или бикарбоната натрия. Тем не менее, для каждого типа клеток должна быть определена оптимальная среда.
- Восстановите 8,67 г порошка среды в 1 л очищенной воды. Добавьте 2,2 г бикарбоната натрия для достижения pH 7,4 и отфильтруйте раствор с помощью вакуумной фильтрации 0,22 мкм.
- Добавьте свежие ингредиенты для получения полной среды (cMEMα) с конечными концентрациями 5,5 мМ глюкозы, 2 мМ глутамина, 1 мМ пирувата и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Дополнительно дополните cMEMα 100 мМ L-карнитином и 10 мкМ HEPES для облегчения окисления жирных кислот.
- Непосредственно перед использованием добавьте 14подложек с маркировкой C в свежеприготовленный cMEMα для приготовления горячей среды. Чтобы сделать олеат горячей средой, добавьте 10 мМ горячий исходный раствор олеата к cMEMα до конечной концентрации 100 мкМ олеата (разведение 1:100, конечная радиоактивность 0,4 μКи/мл).
заметка: Горячий олеат 10 мМ, содержащий соотношение горячего и холодного олеата 1:11,5 (см. шаг 1.3), используют для достижения физиологического уровня 100 мкМ общего олеата в среде при минимизации количества радиоактивного материала.
- Приготовьте 10 мМ немаркированного олеата, добавив 24,36 мг олеата натрия к 2 мл H2O на водяной бане при 70 °C в течение ~20 мин до полного растворения, прежде чем быстро смешать с 6 мл 4 мМ исходного раствора BSA, предварительно подогретого до 70 °C. Переложите на водяную баню при температуре 37 °C на 1 ч и отфильтруйте через фильтр 0,22 мкм. Аликвот и хранить при температуре -20 °C для длительного использования.
- Чтобы получить глюкозу в горячей среде, добавьте 14С-глюкозу до конечной концентрации 1,333 мкМ (разведение 1:4,125, конечная радиоактивность 0,4 μКи/мл). Чтобы сделать глютамин горячей средой, добавьте 14С-глутамин до конечной концентрации 2 мкМ (разведение 1:1000, конечная радиоактивность 0,4 μКи/мл).
- Дополните горячую среду глюкозой и глутамином 10 мМ стоковым раствором немеченого олеата из стадии 2.4 до достижения конечной концентрации 100 мкМ олеата, такой же, как в горячей среде олеата.
3. Подготовка клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве примеров используются кальвариальные преостеобласты и макрофаги костного мозга. Пользователи должны подготовить свой выбор типа ячейки в соответствии с соответствующими протоколами. Оптимизируйте концентрацию коллагеназы II для использования для пищеварения в пилотных экспериментах, поскольку ферментативная активность может варьироваться в разных партиях.
- Выделение и бактериологическое исследование кальвариальных преостеобластов
- Принесите в жертву щенков на 3-5-й день после рождения (P3-5) путем обезглавливания и переведите их в ледяные DPBS, содержащие пенициллин-стрептомицин (P/S).
- Обнажите кальварию, удалив кожу и мягкие ткани. Соберите среднюю область, вырезав окружающие ткани сзади вперед в DPBS (рисунок 1A). Осторожно поцарапывайте внутреннюю и внешнюю поверхности кальварии с помощью пинцета, чтобы помочь высвободить клетки при последующем пищеварении.
- Приготовьте раствор коллагеназы II типа 2 мг/мл и 4 мг/мл в DPBS и отфильтруйте каждый раствор с помощью свежего фильтра 0,22 мкм. Сначала переварите очищенную кальварию с раствором коллагеназы 2 мг/мл в течение 15 минут и выбросьте раствор для варки. Очищенные образцы переваривают в растворе коллагеназы 4 мг/мл 3 раза в течение 15 мин каждый раз, собирая и сохраняя раствор для разложения.
- Фильтруйте раствор для разложения через клеточные сетчатые фильтры 70 мкм и центрифугируйте фильтрат при 300 × г в течение 5 мин. Ресуспендируйте клеточную гранулу в cMEMα (см. шаг 2.2), содержащую 10% FBS и P/S.
- Подсчитайте и засейте клетки в 4 × 10 4 клеток/см2 в 10 см пластинами. Культивируйте клетки в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2 в течение 3 дней.
- Диссоциировать клетки при 37 °C с помощью 0,25% трипсина-ЭДТА. Подсчитывают и засевают клетки в 24-луночные клеточные культуральные планшеты с cMEMα, содержащим 10% FBS и P/S при 7,5 × 105/см2. Засейте не менее 4 лунок для каждого типа клеток на каждый субстрат и не менее трех дополнительных лунок для каждого типа клеток для подсчета клеток перед анализом.
- Культивируйте клетки при температуре 37 °C в течение ночи перед анализом на окисление субстрата.
- Изоляция и культура BMM
ПРИМЕЧАНИЕ: Для культивирования БММ требуется макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), который можно приобрести в продаже в виде рекомбинантного белка. Кондиционированная среда из клеточной линии CMG14-12, разработанная для экспрессии M-CSF, является экономичной альтернативой, используемой здесь.
- Соберите бедренные и большеберцовые кости у 8-недельных мышей после удаления мышц и соединительных тканей. Острыми ножницами разрежьте и выбросьте оба конца костей.
- Вымывайте костный мозг из одной бедренной и одной большеберцовой костей в чашку Петри диаметром 10 см с помощью шприца с иглой 23 G, содержащей 15 мл cMEMα с 10% FBS, P/S и 10% кондиционированной среды CMG14-12 (среда BMM). Культивируйте клетки в чашке Петри в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2.
- Через 3 дня выбросьте питательные среды и промойте DPBS. Диссоциировать присоединенные клетки при 37 °C 0,25% трипсин-ЭДТА в течение 5 мин. Центрифугируйте и ресуспендируйте клеточную гранулу в среде BMM.
- Подсчитывают и засевают клетки в 24-луночные клеточные культуральные планшеты при давлении 7,5 × 105/см2 таким же образом, как описано в 3.1.6. Посев при 37 °C в течение ночи в среде BMM перед началом анализов.
4. Анализ окисления субстрата с ловушкой CO2
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого типа клеток должна быть определена подходящая плотность затравки, чтобы достичь 80-90% слияния до начала анализа. Обратите внимание, что плотность клеток может влиять на метаболическое состояние клеток.
- Промойте ячейки в дополнительных лунках дважды с помощью DPBS. Диссоциировать клетки с 0,25% трипсин-ЭДТА и смешать 20 мкл клеток, ресуспендированных в DPBS, с 20 мкл готового к использованию коммерческого раствора красителя акридина апельсина/пропидия йодида (AO/PI). Определите количество живых клеток с помощью автоматического счетчика ячеек и запишите их количество для окончательных расчетов.
- Дважды промойте клетки в пробирных лунках DPBS. Добавьте 500 мкл горячей среды в каждую лунку для анализа в предназначенном для RAM колпаке для культуры тканей. Запечатайте планшеты парапленкой и инкубируйте клетки в инкубаторе, предназначенном для оперативной памяти, при температуре 37 °C в течение 4 часов.
- Во время инкубации разрежьте фильтровальную бумагу на круглые кусочки, немного превышающие площадь внутри колпачка микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл и плотно вставьте бумагу в колпачок (рис. 1В). Добавьте 200 мкл 1 М хлорной кислоты в каждую пробирку и 20 мкл гидроксида натрия в фильтровальную бумагу, установленную внутри колпачка.
- После инкубации клеток переложите 400 мкл питательной среды из каждой лунки в подготовленные пробирки и немедленно закройте крышки. Оставьте пробирки в штативе для пробирок при комнатной температуре на 1 час.
- Во время инкубации установите для каждой пробирки сцинтилляционный флакон и наполните его 4 мл сцинтилляционной жидкости. Переложите каждый лист фильтровальной бумаги в сцинтилляционный флакон и выдерживайте при комнатной температуре в течение 30 минут.
- Проведите испытания салфеток на вытяжке для культуры тканей, водяной бане (используется для приготовления 14C-олеата), холодильнике, инкубаторе, раковине, земле и любой другой рабочей зоне на предмет потенциального загрязнения оперативной памятью. Поместите бумажные салфетки в сцинтилляционные флаконы со сцинтилляционной жидкостью.
- Измерьте радиоактивность 14C в сцинтилляционных флаконах с помощью сцинтилляционного счетчика. Запишите результаты чтения. При необходимости провести дезактивацию рабочей среды в соответствии с рекомендациями по радиационной безопасности.
