$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE
1. Подготовка светодиода для подсветки синим светом
- Включите светодиодную панель с помощью соответствующего приложения, установленного на планшете/телефоне. Поместите щуп спектрометра в пустую лунку 6-луночной тарелки и настройте светодиодный свет на длину волны, достигающую пика на ~456 нм с помощью приложения. Поместите оптический датчик измерителя оптической мощности в пустой колодец и отрегулируйте мощность светодиодной лампы (~0,61 мВт/см2). Настройки светодиодной подсветки могут быть сохранены и восстановлены в приложении.
- Установите чашку/светодиодную панель в инкубатор при температуре 28 °C. Завершите этот шаг до того, как съемка рыб начнется при 48 hpf.
2. Визуализация личинок данио-рерио, экспрессирующих оптогенетический TDP-43
- Выберите Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] двойную трансгенную рыбу не менее чем до 47 hpf, на основе RFP (opTDP-43h) или EGFP (EGFP-TDP-43z) флуоресценции в позвоночном моторном столбе с помощью эпифлуоресцентного микроскопа, оснащенного объективом Plan-Neofluar 5x/0.15.
- Дехорионат двойных трансгенных рыб Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z].
- Разогрейте 1% низкоплавкую агарозу, содержащую 250 мкг/мл этил3-аминобензоатной метансульфонатной соли, до 42 °С.
- Кратковременно обезболить Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] двойную трансгенную рыбу в концентрации 48 hpf в буфере E3, содержащем такую же концентрацию трикана.
- Выложите каплю подогретой 1% низкоплавящейся агарозы на стеклянную посуду при комнатной температуре. Диаметр куполообразной агарозной капли на стеклянной посуде составляет 8-10 мм.
- С помощью пастеровской пипетки добавьте обезболенную рыбу до низкой температуры плавления в стеклянную форму, а затем перемешайте с помощью пипетки несколько раз. Сведите к минимуму количество буфера Е3, добавляемого в агарозу вместе с рыбой.
- Удерживайте рыбу на боку с помощью иглы шприца во время затвердевания агарозы (обычно ~ 1 минута), чтобы убедиться, что спинной мозг находится в подходящем горизонтальном положении. После застывания нанесите пару капель буфера Е3 на куполообразную рыбу, установленную на агарозе.
- Получение последовательных конфокальных z-сечений спинного мозга путем сканирования с помощью конфокального микроскопа, оснащенного 20-кратной линзой водно-иммерсионного объектива с числовой апертурой 1,00, со скоростью сканирования 4,0 мс на пиксель (12 бит на пиксель), размером шага 1,0 мкм на срез для объектива и комбинацией длин волн возбуждения/излучения: Канал 1) 473/510 нм для EGFP и Канал 2) 559/583 нм для mRFP1.
заметка: Клоака на вентральной стороне рыбы включена в области интереса (ROI) в качестве ориентира, что помогает идентифицировать и сравнить сегменты позвоночника (уровни 16-17) во временных точках.
- Выньте рыбу из агарозы, осторожно расколов агарозу иглой шприца, как только визуализация будет завершена. Следите за тем, чтобы количество времени, в течение которого рыба погружается в агарозу, должно быть как можно короче, хотя заделка агарозы на <30 мин не влияет на жизнеспособность рыбы.
3. Световая стимуляция рыб, экспрессирующих opTDP-43h, путем полевого освещения синим светодиодным (LED) светом
- Добавьте в лунку 7,5 мл буфера E3 и поместите в лунку изображенную Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] двойную трансгенную рыбу. Поместите шестилуночную тарелку на светодиодную панель, держа тарелку и светодиодную панель на расстоянии 5 мм друг от друга с помощью распорки (например, с пятью стеклами).
- Включите синий светодиодный индикатор. Храните некоторых двойных трансгенных рыб Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] в отдельной шестилуночной тарелке, накрытой алюминиевой фольгой, когда необходимы неосвещенные контрольные рыбы (т.е. в темноте).
- После освещения (например, в течение 24 часов при 72 hpf на рисунке 1) визуализируйте спинной мозг освещенной рыбы, повторяя шаги 2.3 - 2.9.
