Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE
1. Скрининг малых молекул in vitro
- Подготовьте пластины для анализа, следуя приведенным ниже инструкциям.
- Налейте автоклавированную дистиллированную воду в стерильное корыто и с помощью многоканальной пипетки выдайте 40 мкл дистиллированной воды из корыта в каждую лунку 96-луночного планшета с плоским дном.
- Подготовьте инструмент для прикалывания и добавьте химикаты.
- Установите лотки для пиннеров (см. Таблицу материалов) рядом с пламенем горелки Бунзена на лабораторном столе. Добавьте в последовательные лотки для пиннеров: 25 мл раствора для очистки штифтов, 35 мл 50% ДМСО (в воде), 45 мл дистиллированной воды, 55 мл 70% этина и 65 мл 95% этиленоксида. Положите по одному листу промокательной бумаги перед каждым лотком.
- Очистите инструмент для установки штифтов, погрузив штифты в чистящий раствор и переместив штифты вверх и вниз три раза (3 раза) в растворе. В этом протоколе «3x» и «10x» определяются как перемещение штифта вверх и вниз в растворе три или десять раз соответственно. Промокните булавки на промокательной бумаге. Повторите эту процедуру еще раз.
- Затем промойте булавки 3 раза в дистиллированной воде, после чего промокните булавки. Повторите процедуру еще раз.
- Наконец, промойте булавки 3 раза в 95% EtOH, а затем промокните булавки. Повторите еще раз. Разожгите шпильку и дайте этанолу испариться.
- Добавьте химикаты из 96-луночных химических планшетов в пробирные пластины, приколов 3x к химическому планшету, а затем перенеся штифты 10X в пробирную пластину. Промокните на бумаге перед чистящим раствором.
- Очистите инструмент для прикалывания между пластинами, промыв в следующем порядке, промокнув между ними на промокательной бумаге: 3 раза в 50% ДМСО (один раз), 3 раза в дистиллированной воде (один раз), 3 раза в 75% EtOH (один раз), 3 раза в 95% EtOH (дважды). Разогрейте пиндер и дайте этанолу испариться.
- Повторите шаг 1.2.2, когда все закрепления будут завершены.
заметка: Скрининг проводили при конечной концентрации 60 мкМ.
- Добавление червей
- Подсчитайте количество нематод из коллекции, сначала суспендируя, а затем пипетируя 5 мкл с помощью наконечников с низким удержанием на предметное стекло для наблюдения. Подсчитайте количество нематод в 5 мкл с помощью диссекционного микроскопа.
- Отрегулируйте концентрацию до 2 червей/мкл с помощью стерильной дистиллированной воды. С помощью многоканальной пипетки и корыта добавьте по 10 мкл (~20 червей) в каждую лунку из 96-луночных планшетов.
заметка: Приблизительно 15 000 нематод D. dipsaci будут собраны на одну культуральную пластину с использованием описанного метода культуры и сбора. На одну скважину используется двадцать червей, так как малое их количество способствует четкой визуализации и учету подвижных и неподвижных.
- Запечатайте пластины в лабораторную упаковочную пленку и оберните влажным бумажным полотенцем. Поместите в коробку и закрепите на липкой прокладке при температуре 20°C встряхивающий инкубатор, установленный на 200 оборотов в минуту. Убедитесь, что пластины стабилизированы в коробке, добавив дополнительное влажное бумажное полотенце, чтобы обеспечить минимальное перемещение тарелок.
2. Сбор и анализ данных
- Понаблюдайте за планшетами на 5-й день под препарирующим микроскопом. Подсчитайте количество подвижных и общее количество D. dipsaci в контрольных растворителях ДМСО и лунках, обработанных лекарственными препаратами.
- Если черви относительно неподвижны, добавьте в лунку 2 мкл 1 М NaOH до конечной концентрации 40 мМ, чтобы стимулировать движение><.
заметка: После добавления NaOH черви будут перемещаться мгновенно, и их нужно будет рассмотреть в течение 5 минут. Количество мобильных червей и общее количество червей будут использоваться для расчета доли мобильных червей. Продолжительность анализа может меняться в зависимости от направления ситона.
- Рассчитайте долю мобильных червей. На грохотах D. dipsaci скважины, которые воспроизводимо дали 0% подвижных червей, классифицируются как сильные попадания.
заметка: Длительная экспозиция пластин на столешнице диссекционных микроскопов избегается, поскольку источник света может нагревать пластины и вызывать переменные эффекты на биопробу.
