Анализ минерализации in vitro: колориметрический метод количественного определения отложений кальция остеобластов на заменителе костного трансплантата путем окрашивания и экстракции Alizarin red S

Аннотация

Источник: Kampleitner, C. et al. Профиль биологической совместимости биоматериалов для регенерации костей. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео мы описываем метод обнаружения отложений кальция, секретируемых остеобластами, с помощью анионного красителя Alizarin Red S. Культивируемые остеобласты сначала окрашивают, а затем восстанавливают краситель для колориметрического количественного определения отложений кальция или степени минерализации остеобластов.

Протокол

1. Анализ оруденения остеобластов

1. Предварительно инкубируйте диски β-трикальцийфосфата (β-TCP) диаметром 14 мм в 1 мл среды для роста костей (BGM) в 24-луночном планшете для культивирования суспензии при 37 °C и 5% CO₂ в течение 24 ч перед добавлением остеобластов (OB). Используйте стандартные планшеты для культивирования тканей для контроля и планшеты для суспензионных культур для образцов биоматериала, чтобы избежать прикрепления клеток к пластику.
2. Аспирируйте предварительную инкубационную среду, а затем ресуспендируйте первичные OB мышей в фоновой музыке. Добавьте 8,8 x 10⁴ OBs/см² на предварительно инкубированные диски β-TCP в 24-луночном планшете для суспензии и для контрольной группы в 24-луночный планшет для культуры тканей (1 мл/лунка). Акушеры прикрепляются к планшету для культуры тканей или образцу биоматериала.
3. Замените ОГД 1 мл остеогенной минерализационной среды (ММ), содержащей ОГМ, 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты и 5 мМ β-глицерофосфата, через 24 ч после добавления ОБ и инкубируйте в течение 14 дней при 37 °C и 5% CO₂. Меняйте среду каждые 2–3 дня по 1 мл свежеприготовленного ММ в каждую лунку.

2. Минерализация остеобластов оценена путем окрашивания Alizarin Red S (ARS)

1. Отсадите питательную среду из лунок, содержащих первичные ОВ, через 14 суток после добавления ММ и дважды промойте 0,5 мл 1x PBS при РТ. Аспирируйте PBS и зафиксируйте клетки, добавив 0,5 мл 10% буферизованного раствора формалина при РТ в течение 10 мин.
2. Отсадите 10% буферизованный формалин с помощью одноразовой пипетки и дважды промойте 0,5 мл сверхчистой воды.
3. К неподвижным ОБ добавьте 0,25 мл 40 мМ окрашивающего раствора ARS (pH 4,2), растворенного в сверхчистой воде, и инкубируйте планшет при RT в течение 10 мин на шейкере со скоростью 100 встрясок/мин.
4. Отсадите окрашивающий раствор с помощью одноразовой пипетки и промойте 1 мл сверхчистой воды. Повторите этот шаг 5–10 раз, чтобы удалить неспецифические пятна.
   заметка: Раствор для полоскания должен быть бесцветным.
5. Отсадите сверхчистую воду и добавьте 1 мл холодной PBS. Инкубируйте тарелку при RT в течение 10 минут на шейкере со скоростью 100 встряхиваний/мин.
6. Отсадите PBS, перенесите окрашенные диски β-TCP в новую скважину и отсканируйте пластины с помощью планшетного сканера для регистрации минерализации.
7. Добавьте 0,25 мл 10% раствора цетилпиридиния хлорида и инкубируйте планшет при RT в течение 15 мин на шейкере со скоростью 100 вспышек/мин для извлечения красителя ARS.
8. Перенесите надосадочную жидкость в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте при 17 000 x g в течение 5 минут при RT.
9. Добавьте 10% раствор цетилпиридиния хлорида к экстрактам с коэффициентом разведения 1:10–1:20 и добавьте образцы (300 мкл) в 96-луночный планшет, включающий две глухие лунки, содержащие только 10% цетилпиридиния хлорида.
10. Приготовьте 7 стандартных образцов ARS в диапазоне от 4 до 400 мкМ путем разбавления 40 мМ окрашивающего раствора ARS (pH 4,2) 10% раствором хлорида цетилпиридиния для получения стандартной кривой.
11. Добавьте 300 мкл эталона в двух экземплярах в 96-луночный планшет.
12. Считайте абсорбцию образцов, заготовок и эталонов при длине волны 520 нм.
13. Вычтите пустые показания из стандартных образцов и образцовых показаний.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
β-трикальцийфосфатные диски (β-TCP, 14 мм)			Диски спекали в муфельной печи при температуре 1150 °C. Образцы облучали ультрафиолетовым излучением (по 15 мин с каждой стороны) перед использованием в клеточных культурах
Ализарин Ред С	Сигма-Олдрич	А5533
Среда для роста костей (BGM)			α-MEM + 10% инактивированный при нагревании FBS + 1% пенициллин/стрептомицин
Раствор формалина нейтральный буферный 10%	Сигма-Олдрич	HT501128
Моногидрат гексадецилпирдиния (цетилпиридиния) хлорида	Сигма-Олдрич	С9002
L-аскорбиновая кислота 2-фосфат сесквимагния соль гидрат	Сигма-Олдрич	А8960
MEM альфа-среда (α-MEM)	Технологии Gibco Life	11900-073
Остеогенная среда минерализации (ММ)			α-MEM + 10% инактивированный при нагревании FBS + 1% пенициллин-стрептомицин + 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты + 5 мМ β-глицерофосфат
Пенициллин-стрептомицин	Сигма-Олдрич	П4333
Фосфатно-солевой буфер 1x (PBS) pH 7,4	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10010023
β-Глицерофосфат динатриевая соль гидрат	Сигма-Олдрич	Г5422
Сверхчистая вода: Вода для клеточных культур не содержит пирогенов	ВВР	Л0970-500
96-луночная прозрачная пластина	Грайнер биоуан	655001
24-луночная суспензионная культуральная пластина	Грайнер биоуан	662102
24-луночный планшет для культивирования тканей	Грайнер биоуан	Номер 662160
Центрифуга: VWR Mega Star 600R	ВВР
CO2-инкубатор: HeraCell 240	Термо Сайентиал
Планшетный сканер: Epson Perfection 1200 Photo	Эпсон
Считыватель микропланшетов Infinite M200 Pro	Текан
Микроцентрифужная пробирка: Eppendorf tube safe-lock 1,5 мл	ВВР	21008-959
Встряхивание инкубатора GFL3032	ГФЛ	No 3032
Одноразовая пипетка: сывороточная пипетка	Грайнер биоуан	612301