1. Подготовка бусин к имплантации геля
- Возьмите культуру, содержащую микроносители, покрытые эндотелиальными клетками пупочной вены человека (HUVEC) и перицитами.
- Рассмотрите чашки, содержащие гранулы, покрытые микроносителями, под микроскопом с помощью объектива 20X, чтобы убедиться, что все гранулы были в достаточной степени покрыты эндотелиальными клетками.
- Энергично пипетируйте напыленный раствор клеток, чтобы отсоединить их от 6-сантиметровой пластины и поместить раствор в пробирку. Промойте пластину еще 2 раза полным материалом и переложите в трубку, чтобы собрать все остатки гранул, которые могут прилипнуть к пластине.
- Избегайте попадания пузырьков воздуха и используйте пипетку p1000, чтобы свести к минимуму напряжение сдвига на гранулах, покрытых эндотелиальными клетками.
- Подождите 3 минуты, чтобы шарики в растворе осядли на дно трубки.
- Удалите как можно больше надосадочной жидкости, не потревожив гранулу шарика, с помощью наконечника пипетки p1000 (не используйте вакуумный аспиратор).
- Добавьте 1 мл готовой среды в каждую пробирку и снова суспендируйте шарики.
- Подождите 30-60 с, чтобы бусины осядли на дно. Затем удалите как можно больше надосадочной жидкости с помощью пипетки P1000, не повреждая гранулы. Не используйте вакуумный аспиратор, так как вероятность случайного удаления гранул значительно увеличивается.
- Повторите шаги 1.6 и 1.7 еще два раза. Цель состоит в том, чтобы удалить как можно больше свободно плавающего HUVEC, который мог быть отделен от 6-сантиметровой пластины, при этом не удаляя слишком много гранул с покрытием HUVEC, которые должны осесть в трубках с круглым дном для сортировки флуоресцентных активированных клеток (FACS) быстрее, чем свободно плавающие клетки.
- Добавьте в бусины 1 мл готового материала.
2. Встраивание покрытых бусин в фибриновый гель
- Удалите как можно больше среды, не повреждая гранулу в каждой пробирке FACS с помощью пипетки P1000.
- Суспендируйте шарики в 2,5 мл раствора фибриногена.
- Внесите пипеткой 13 μл раствора тромбина в каждую желаемую лунку 24-луночного планшета со стеклянным дном. Нанесение покрытия на пластину со стеклянным дном имеет важное значение для обеспечения оптимальной визуализации ростков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте тромбин в лунке более чем на 5-10 минут перед следующим этапом.
- Добавьте в каждую лунку по 0,5 мл раствора шариков/фибриногена.
- Обязательно повторно суспендируйте раствор в гранулах задолго до каждого пипетирования раствора.
- Будьте осторожны и осторожно вводите пипетку непосредственно в тромбин, уже присутствующий в лунке. Медленно пипеткой вверх и вниз 2-3 раза, чтобы тщательно перемешать раствор, соблюдая осторожность, чтобы не попасть пузырьки воздуха.
- Обязательно меняйте наконечник пипетки между лунками.
- Будьте осторожны, не двигайте и не тревожьте пластину в любой момент во время первоначального свертывания фибрина, так как любое движение может нарушить образование геля.
- Оставьте тарелку в вытяжке на 30 минут при комнатной температуре.
- Осторожно перенесите планшет в инкубатор с температурой 37 °C еще на 1,5-2 часа, чтобы гель полностью застыл
3. Нанесение фибробластов поверх фибринового геля
- В течение последних 30 минут затвердевания геля отделите нормальные фибробласты легких человека (NHLF) следующим образом:
- Промойте колбу T175 с клетками 10 мл фосфатно-солевого буфера (PBS), затем добавьте 5 мл раствора для отделения клеток и инкубируйте при 37 °C в течение 10 минут.
- Ресуспендия NHLF в концентрации 20 000 клеток/мл в полной среде.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки NHLF можно культивировать с помощью модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина стрептомицина.
- Нанесите 1 мл клеточной суспензии NHLF на гель каждой лунки и поместите его обратно в инкубатор.
- Меняйте готовые среды через день в течение всего анализа.
