1. Контактный анализ личинок (одноточечный анализ дозы или анализ реакции на дозу)
>ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ можно проводить с химическими составами, растворимыми в воде или диметилсульфоксиде (ДМСО), при условии, что конечная концентрация ДМСО в тестовых лунках не превышает 1%. Альтернативные растворители могут быть одним из вариантов, но важно сначала подтвердить, что конечная концентрация не вызывает смертность более чем на 10% через 72 часа после воздействия. Анализ может быть выполнен в виде одноточечного анализа дозы или анализа «доза-ответ». При выполнении последнего рекомендуется протестировать диапазон концентраций (минимум пять), охватывающий ожидаемый ЛК50.
- Пометьте лунки прозрачной 24-луночной тканевой пластиной.
- Приготовьте исходный раствор исследуемой химии в пробирке объемом 1,5 мл.
- Взвесьте каждый химический состав с помощью аналитических весов и, в зависимости от характеристик растворимости, повторно суспендируйте в стерильном ddH2O, ДМСО или другом подходящем органическом растворителе по вашему выбор><у.
заметка: При расчетах следует учитывать чистоту химического состава. Например, для химического вещества, которое является чистым на 99%, растворите 10,1 мг в 1000 мкл ацетона, чтобы получить 1% раствор. Запечатать парафиновой пленкой и хранить при температуре -20 °C.
- Определите конечную концентрацию испытуемого химического вещества, которое будет оцениваться, и приготовьте серийные разведения из исходного раствора с использованием соответствующего растворителя.
заметка: Концентрацию и объем химического состава и растворителя можно рассчитать по формуле C1*V1=C2*V2, где C1=концентрация образца 1, C2=концентрация образца 2, V1=объем образца 1 и V2=объем образца 2.
- Приготовьте стоковый раствор в концентрации 10 мМ и серийные разведения по мере необходимости для получения желаемых концентраций теста (Таблица 1B).
- С помощью пластиковой переводной пипетки с широким отверстием перенесите пять личинок L3 в лунку тестовой пластины для культуры тканей; Личинки L3 можно распознать по длине (~2,5 - 3,5 мм) и ширине головной капсулы ~0,025 мм. Аккуратно удалите воду с помощью пипетки объемом 1 мл и замените ее желаемым объемом ddH2O. Повторите для получения n = 4 технических повторов за одну обработку (т.е. всего 20 личинок за одну обработку).
- Добавьте соответствующий объем тестового химического состава в каждую из четырех повторяющихся лунок в 24-луночной испытательной пластине и осторожно поверните пластину, чтобы обеспечить равномерное смешивание химических веществ. Поместите планшет в тестовую камеру или камеру для выращивания в постоянных условиях (например, рекомендуется 25 °C и ~ 75-85% относительной влажности, а также 12 часов в темноте, если это возможно><).
заметка: Для воспроизводимости между экспериментами убедитесь, что последующие анализы проводятся в одних и тех же условиях окружающей среды.
- Запишите количество мертвых/нечувствительных личинок в каждой лунке через 30 мин, 1, 1,5, 2, 3, 24, 48 и 72 ч после воздействия (или в альтернативные моменты времени) на листе результатов (Таблица 2). Аккуратно постучите по боковой стороне тарелки. Если движения не наблюдается, аккуратно прикоснитесь к личинке стерильной зубочисткой. Оценивайте личинок, которые не реагируют на постукивание/прикосновение, как "мертвых".
заметка: Могут наблюдаться и регистрироваться другие морфологические и поведенческие фенотипы.
- При желании скорректируйте контрольную смертность с использованием модифицированной формулы Эбботта, как следует:
Смертность (%) = (X-Y) *100/(100-Y),
где X = процент смертности в обработанной выборке, а Y = процент смертности в контроле.
- Результаты построения графика представляют собой гистограмму или логарифмическую кривую с использованием программного обеспечения по выбору, такого как Graph-pad Prism 6 или аналогичного, и вычисляют значения смертельной концентрации (LC) относительно контрольной группы.
- Повторите анализ с использованием отдельной партии комаров для получения n = 3 и более биологических репликатов.
Таблица 1. Примеры расчетов для анализа личинок Aedes aegypti L3 (A) в одной точке и (B) анализа «доза-реакция».
| A. Одноточечные анализы дозы с тремя химическими веществами |
| химия | Концентрация (400 мкМ) |
| Амитриптилин | 80 мМ Запас: 2 мг амитриптилина X 98% (чистота порошка) X 0,001 г/1 мг X 1 моль /313,86 г X 1 л/0,08 моль X10 6 мкл/л = 78,06 мкл воды. |
| Серийные разведения: Разбавьте запас 1:2 ddH2O, а затем 1:4 для достижения 10 мМ. Добавьте 40 мкл 10 мМ материала в лунку, содержащую 960 мкл ddH20 для достижения конечной концентрации 400 мкМ/лунка. Приготовьте последовательные разведения 10 мМ 1 мМ 1:2 для получения 5 мМ, 2,5 мМ, 1,25 мМ и 0,625 мМ. |
| Цис-(z)-флупентиксол | 80 мМ Запас: 2 мг цис(z)флупентиксола X 98% (чистота порошка) X 0,001 г/1 мг X 1 моль/507,44 г цис(z)флупентиксол X 1л/0,08 моль X10 6 мкл/л = 48,28 мкл воды. |
| Серийные разведения: Как указано выше. |
| Амитраз | 80 мМ Запас: 2 мг амитраза X 0,001 г/1 мг X 1 моль/293,4 г амитраза X 1 л/0,08 моль X10 6 мкл/1 л = 85,21 мкл ДМСО (примечание: амитраз растворим только в ДМСО). |
| Серийные разведения: Как указано выше. |
| B. Анализ "доза-ответ" |
| Химия | Доза 1 | Доза 2 | Доза 3 | Доза 4 | Доза 5 |
| 400 мкМ | 200 мкМ | 100 мкМ | 50 мкМ | 25 мкМ |
| например, Амитриптилин, цис-(Z)-флупентиксол орамитраз | 40 μл | 40 μл | 40 μл | 40 μл | 40 μл |
| Стоковый 10 мМ | Склад 5 мМ | Запас 2,5 мМ | Склад 1,25 мМ | 0,625 мМ запас |
Таблица 2. Пример оценочного листа, используемого для записи данных анализа доза-реакции личинок комаров. Контрольная, только вода или вода с 1% ДМСО или только другим растворителем. Типичные дозы, используемые для тестирования низкомолекулярных антагонистов химических веществ, таких как амитриптилин, составляют 25 μМ, 50 μМ, 100 μМ, 200 μМ и 400 μМ.
| Анализ личинок комара L3 |
| Дата начала: |
| Следователь: |
| Вид/Штамм: |
| Тип анализа: Одноточечная доза/реакция на дозу |
- Смертность (количество мертвых комаров)
| | |
| Время (часы) | Доза 1 | Доза 2 | Доза 3 | Доза 4 | Доза 5 | контроль |
| 0,5 | | | | | | |
| 1 | | | | | | |
| 1.5 | | | | | | |
| 2 | | | | | | |
| 2.5 | | | | | | |
| 3 | | | | | | |
| 12 | | | | | | |
| 24 | | | | | | |
| 48 | | | | | | |
| 72 | | | | | | |
- Процент смертности
|
| Время (часы) | Доза 1 | Доза 2 | Доза 3 | Доза 4 | Доза 5 | контроль |
| 0,5 | | | | | | |
| 1 | | | | | | |
| 1.5 | | | | | | |
| 2 | | | | | | |
| 2.5 | | | | | | |
| 3 | | | | | | |
| 12 | | | | | | |
| 24 | | | | | | |
| 48 | | | | | | |
| 72 | | | | | | |
