$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE
1. Культура взрослых комаров
ПРИМЕЧАНИЕ: Чувствительные к инсектицидам штаммы комаров доступны в Справочном репозитории по исследованиям и реагентам малярии. Рекомендуемые штаммы: штамм Aedes aegypti Liverpool (LVP), штамм Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) и штамм Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB).
- Культивируйте личинок комаров из яиц в цикле 12 ч день/12 ч ночью при 28 °C и относительной влажности воздуха (RH) 75-85% в пластиковых лотках размером 25 см x 40 см (~ 400 личинок на лоток), как описано Нуссом. Кормите личинок молотой песчанкой (A. aegypti и An. gambiae) или хлопьевидным кормом для рыб (C. quinquefasciatus). Для анализа на личинок собирают личинки на стадии третьей личинки (L3) стадии.
- Взрослых комаров вырастить из куколок, которые были перенесены в пластиковые стаканчики, и поместить в пластиковые клетки объемом 20 л в инсектарии в условиях, описанных выше. Держите комаров на 20% растворе сахара, как описано в другом месте. Собирают взрослых особей на 3-5 день после появления всходов.
2. Взрослый топический анализ (одноточечный анализ дозы или анализ реакции на дозу)
ПРИМЕЧАНИЕ: Местный анализ для взрослых проводится с использованием ацетона в качестве растворителя. Альтернативные растворители могут быть одним из вариантов, но важно сначала подтвердить, что конечная концентрация не вызывает смертность более чем на 10% через 48 часов после воздействия. Анализ может быть выполнен в виде одноточечного анализа дозы или анализа «доза-ответ» и используется для определения смертельной дозы (ЛД). При выполнении последнего рекомендуется протестировать диапазон концентраций (минимум пять), охватывающий ожидаемый ЛД50.
- Определите количество взрослых самок комаров, необходимое для завершения анализа.
заметка: Для анализа точечной дозы с одним биохимическим методом потребуется минимум 90 комаров (30 для положительного контроля, 30 для отрицательного контроля, содержащего только ацетон, и 30 для тестового химического анализа).
- Культивируйте взрослых самок комаров в возрасте от 3 до 5 дней и переместите в отдельное пластиковое ведро объемом 20 мл с помощью аспиратора (рисунок 1).
- Наклейте этикетки на бумажные стаканчики на 9 унций с названием и концентрацией исследуемого химического вещества. Отложите в сторону квадраты сетки размером 10 см x 10 см и резинки для каждой чашки (см. рисунок 2).
- Выберите существующий инсектицид в качестве положительного контроля (например, синтетический пиретроид, бифентрин) и приготовьте 1% исходный раствор (10 мкг/мкл) в ацетоне><.
ПРИМЕЧАНИЕ: Расчеты должны учитывать чистоту химического состава. Например, для химического вещества, которое является чистым на 99%, растворите 10,1 мг в 1000 мкл ацетона, чтобы получить 1% раствор. Запечатать парафиновой пленкой и хранить при температуре -20 °C.
- Используя ту же процедуру, что и выше, приготовьте исходный раствор исследуемой химии.
заметка: Многие тестируемые химические реагенты обладают высокой лабилизацией, и предпочтительно каждый раз при проведении биоанализа следует готовить свежие растворы.
- Готовьте серийные разведения положительного контроля и тестируемого химического состава из исходных растворов, как показано на рисунке 3, используя стеклянные флаконы объемом 20 мл, предварительно промытые ацетоном.
- Продуйте стеклянный шприц объемом 1 мл ацетоном, заполните его ацетоном и закрепите в микроаппликаторе, отрегулированном на подачу объема 0,25 мкл.
- Работая партиями по десять человек, удалить 3-5-дневных взрослых самок комаров из клеток с помощью аспиратора и обезболить до пяти минут при температуре 4 °C в холодильнике или на льду. Далее перенесите комаров в чашку Петри и положите на лед на срок до 10 минут.
- Работая быстро, удалите одну самку тонким пинцетом и нанесите 0,25 мкл исследуемого раствора на дорсальную поверхность грудной клетки с помощью микроаппликатора шприца. Подтвердите подачу химического вещества путем наблюдения с помощью препарирующего микроскопа, чтобы убедиться, что каждый комар получает соответствующий объем исследуемого химического вещества.
- Переложите комара на промаркированный бумажный стаканчик, лежащий на льду, и повторите девять раз, чтобы получить n = 10 обработанных комаров. Запечатайте комаров в стаканчике сетчатым квадратом, закрепленным резиновой лентой, и переложите в пластиковую ванну или камеру для выращивания при постоянных условиях 28 °C и относительной влажности 75-85% (предпочтительно при 12-часовом дневном/12-часовом ночном цикле).
- Повторите описанный выше эксперимент дважды, чтобы получить n = 3 технических повторов (т.е. всего 30 комаров) на группу обработки или контрольную группу.
- Повторите шаги 2.7 - 2.10 сначала с анализом химического состава, а затем с положительным контролем.
заметка: Еще одним полезным мерой контроля, который следует включить при наличии достаточного количества комаров, является «пустота» из 30 обезболенных комаров, которые не получают ни тестового химического состава, ни растворителя.
- Запишите количество «мертвых/не реагирующих» комаров через 30 минут, 60 минут, 2, 24 и 48 часов после контакта (или в альтернативные моменты времени) с помощью таблицы результатов (Таблица 1). Оценивайте комаров как «мертвых/не реагирующих», если они демонстрируют недостаток движения, определяемый как лежание на боку или на спине и неспособность летать.
- При желании скорректировать контрольную смертность с помощью модифицированной формулы Эбботта следующим образом:
Смертность (%) = (X-Y) *100/(100-Y),
где X = процент смертности в обработанной выборке, а Y = процент смертности в контроле.
- Отображение результатов в виде гистограммы или экспоненциальной кривой. Для анализа «доза-реакция» рассчитайте значение LD50, LD75 илиLD 90 для химического состава теста относительно контроля.
- Повторите анализ не менее двух раз с использованием отдельных партий комаров для получения n = 3 или более биологических репликатов.
