$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Анализ крови у взрослых (одноточечная доза или анализ доза-ответ)
- Соберите примерно 150 взрослых самок комаров в возрасте 4-5 дней и пересадите в отдельную клетку. Повторите для получения 6 кейджей при выполнении анализа «доза-ответ». Уберите источник сахара за 1-24 ч до начала анализа на кормление.
- Приготовьте стоковый химический раствор, как описано выше, с учетом чистоты химического состава (типичный стоковый раствор составляет 80 мМ в воде или солевом буфере), а затем приготовьте серийные разведения в воде/буфере по мере необходимости.
- Добавьте по 40 мкл каждого из разведений к 960 мкл дефибринированной крови кролика для получения желаемой исследуемой концентрации. Наклейте мембранную пленку на подающий узел и запечатайте резиновым кольцом. Перелейте 1 мл крови через пипетку и прикрепите блок подачи к нагревательному блоку.
- Аккуратно промокните поверхность мембраны свежеприготовленным 10% раствором молочной кислоты и поместите блок кормления в клетку со взрослыми комарами. Накройте клетку темной тканью или черным мешком для мусора и дайте комарам покормиться в течение одного часа.
- Повторите шаги 1.2 - 1.4 для оставшейся части тестовых растворов и отрицательного (только с кровью) контроля.
- По окончании кормления поместите ведра при температуре 4 °C в холодильник на 5 минут для обезболивания комаров. Удалите самцов комаров и некормленных самок, а также подсчитайте и запишите общее количество прокормленных и частично прокормленных комаров путем осмотра брюшной полости.
- Оставляйте частично и полностью откормленных самок комаров, стремясь к тому, чтобы за одну дозу приходилось не менее 50 комаров, питающихся кровью.
- Переложите ведра в пластиковую кадку или камеру для выращивания в постоянных условиях 28 °C и относительной влажности 75 - 85% (предпочтительно при 12-часовом дневном/12-часовом ночном цикле).
- Запишите общее количество мертвых/не реагирующих комаров через 0,5, 1, 1,5, 2, 24, 48 и 72 часа (или альтернативные временные точки по желанию) с помощью таблицы результатов (Таблица 1).
- На третий день после кормления кровью введите в клетку чашку с яйцом и собирайте яйца в течение 72 часов. Подсчитайте общее количество яйцеклеток, полученных за одну обработку, под микроскопом.
- Рассчитайте процент смертности и плодовитости в зависимости от общего количества откормленных комаров для каждой группы обработки и контроля. При желании сделайте коррекцию для контроля смертности, используя модифицированную формулу Эбботта.
- Отображайте данные о токсичности и плодовитости в виде гистограммы или экспоненциальной кривой (при выполнении анализа «доза-реакция») с помощью программного обеспечения по выбору. При проведении анализа «доза-реакция» рассчитайте значение LD50, LD75 илиLD 90 для исследуемого химического состава относительно контрольной группы.
- Повторите анализ не менее двух раз с использованием отдельных партий комаров для получения n = 3 или более биологических репликатов.
Таблица 1. Пример оценочного листа, используемого для записи данных анализа крови у взрослых.Типичные дозы, используемые для тестирования низкомолекулярных антагонистов химических веществ, таких как амитриптилин, составляют 50 мкМ, 100 мкМ, 200 мкМ и 400 мкМ.
| Комар Взрослый (3-5-дневный) Топический анализ |
| Дата начала: |
| Следователь: |
| Вид/Штамм: |
| Тип анализа: Одноточечная доза/доза-реакция |
| A. Смертность (количество мертвых комаров) |
| Время (часы) | Доза 1 | Доза 2 | Доза 3 | Доза 4 | Доза 5 | контроль |
| 0,5 | | | | | | |
| 1 | | | | | | |
| 1.5 | | | | | | |
| 2 | | | | | | |
| 2.5 | | | | | | |
| B. Процент смертности |
| Время (часы) | Доза 1 | Доза 2 | Доза 3 | Доза 4 | Доза 5 | контроль |
| 0,5 | | | | | | |
| 1 | | | | | | |
| 1.5 | | | | | | |
| 2 | | | | | | |
| 2.5 | | | | | | |