1. Производство лентивирусов
ПРИМЕЧАНИЕ: Производство и манипуляции с лентивирусными векторами проводились в соответствии с рекомендациями Национальных институтов здравоохранения (NIH) по исследованиям с использованием рекомбинантной ДНК. Используется плазмида, кодирующая дикий тип и мутантный A4V SOD1, меченный усиленным YFP (SOD1WT-YFP и SOD1A4V-YFP). Оба продукта слияния генов амплифицировали с использованием ПЦР-праймерной пары 5'-ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC-3' и 5'-TAGCGG CCGCTACTTACACCTCGTCCATGCC-3' и вставляли в плазмиду pTRIP-delta U3 CMV с использованием сайтов рестрикции XhoI и BsrGI. Избегание более 20 пассажей и поддержание конфлюенции клеток на уровне менее 60% помогает обеспечить хорошую эффективность трансфекции.
- В 1-й день расщепляют клетки HEK-293T при 30-40% слиянии в тканевом планшете диаметром 10 см (3 x 10⁶ клеток/чашку) в 10 мл клеточной культуральной среды (DMEM с высоким содержанием глюкозы и 10% FBS и 4 мМ L-глутамина) для производства вируса.
- Поместите планшет для культуры тканей диаметром 10 см в CO₂-инкубатор (37 °C, 5% CO₂) на ночь.
- На 2-й день приготовьте раствор для трансфекции ДНК, содержащий 10 мкг лентивирусных векторов (pTRIP-delta U3 CMV - SOD1WT-YFP или -SOD1A4V-YFP) вместе с плазмидами лентивирусной упаковки (5 мкг pVSVg; 10 мкг pCMV-dR8.71) (рис. 1A). Добавьте 125 μL 1 М CaCl₂ и отрегулируйте объем до 500 μL с помощью дистиллированной воды. Аккуратно добавьте в смесь 500 μл 0,05 М HEPES и выдерживайте в течение 10 минут при комнатной температуре.
- Замените клеточную среду HEK-293T 10 мл предварительно подогретой свежей питательной среды без антибиотиков, смешанной с 1 мл раствора для трансфекции ДНК и инкубируйте в течение ночи при 37 °C, 5% CO₂.
- На 3-й день замените надосадочную жидкость для клеток свежей питательной средой.
- На 4-й день соберите надосадочную жидкость в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте в течение 5 минут при 500 x g для удаления мертвых клеток и мусора. Далее очистите надосадочную жидкость, пропустив ее через фильтр 0,45 мкм с помощью большого шприца объемом 60 мл. Немедленно разложите на одноразовые аликвоты (300 μл) и храните при температуре -80 °C. Чтобы сохранить максимальную активность продукта, избегайте цикла замораживания-размораживания.
2. Лентивирусная трансдукция
- Разделите инфицированную клеточную линию при 60% слиянии (клетки HEK-293 и SH-SY5Y; 5 x 10⁵ клеток на лунку и U2OS; 1 x 10⁵ клеток на лунку) в 6-луночном тканевом планшете в 2 мл среды DMEM с добавлением 10% FBS.
- Храните 6-луночный планшет для культивирования тканей в инкубаторе при температуре 37 °C при 5% CO₂ в течение ночи.
- Извлеките замороженный лентивирус из морозильной камеры при температуре -80 °C и размораживайте аликвоту на льду перед каждым использованием; не замораживайте повторно.
- Пока вирус оттаивает, согрейте среду для культивирования клеток, содержащую сыворотку, совместимую с представляющей интерес клеточной линией. Как только вирус полностью разморозится, приготовьте ряд разведений (1:3, 1:10, 1:30 и 1:100) в DMEM в свежей микрофужере объемом 1,5 мл.
- Доведите объем в пробирках до 1 мл с уменьшенным содержанием сывороточных сред.
- Добавьте 2 мкл полибрена (в концентрации 4 мкг/мкл) в 1 мл вируса/среды. Хорошо перемешайте с помощью пипетирования и добавьте в клетки 1 мл смеси. Инкубируйте клетки с вирусом в течение 24 ч.
- Удалите вирусный носитель и замените его на обычный носитель DMEM с добавлением 10% FBS. Поддерживайте в клетках температуру 37 °C, 5% CO₂.
- Следите за ростом клеток и меняйте питательные среды каждые два дня. При слиянии разверните 6-луночную чашку в тарелку для культуры тканей диаметром 10 см.
- После того, как клетки достаточно разрослись, засейте 1,5 x 10⁴ клеток в лунку в 50 мкл среды DMEM на 384-луночных испытательных планшетах, чтобы проверить уровень экспрессии белка, меченного YFP, с помощью микроскопии. Если клеточная экспрессия белка, меченного YFP, показывает отношение сигнал/шум ≥3, подготовьте клеточный запас для соответствующей клеточной линии.
3. Зависящее от времени влияние ингибитора протеасом на агрегацию белков
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните получение изображений с помощью автоматического микроскопа (см. раздел Материалы).
- Дозируйте 0,25 мкл ДМСО или ингибитора протеасом, растворенного в 100% ДМСО (ALLN, 2 мМ) на 384-луночных планшетах с плоским дном.
- Вручную засейте 1,5 x 104 клетки в лунку по 50 мкл среды DMEM на той же испытательной пластине. Конечная концентрация ингибитора протеасом (ALLN) должна составлять 10 мкМ.
- Установите в микроскопе систему контроля окружающей среды на 37 °C и 5% CO₂. Скриншот экспериментальной установки показан на рисунке 2.
- Работа с микроскопом осуществляется в широкопольном флуоресцентном режиме, используя программное обеспечение со следующими настройками: объектив LWD 20X, неконфокальный режим, 4 поля/лунка, с интервалом съемки час. В конце каждого прогона отснятые изображения автоматически загружаются на сервер.
4. Покадровая визуализация экспрессии YFP в живых клетках и анализ изображений (одноканальный)
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги описывают применение программного обеспечения (например, Columbus).
- Выберите подходящий алгоритм для сегментации первичных объектов (цитозоля и агрегатов). При необходимости отрегулируйте порог фона и параметры контрастности (рис. 3).
- Подсчитывайте ячейки с помощью функции «найти ячейки» с индивидуальным пороговым значением 0,1 для канала интенсивности YFP. Определите агрегаты с помощью алгоритма «найти точки» с относительной интенсивностью пятен YFP >0,2 и коэффициентом разбиения 1,0.
5. Влияние ингибиторов протеасомных на агрегацию белков на живых клетках, окрашенных под их ядра (два канала)
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте получение изображений с помощью автоматического микроскопа. Определите диапазон концентраций ингибиторов протеасомы (ALLN, эпоксомицин и MG132) на основе ожидаемого значения IC50 для обеспечения оптимальной подгонки кривой.
- Готовьте серийные разведения соединений на 384-луночном полипропиленовом планшете стандартной серии разбавления 1:3. Обязательно хорошо перемешайте составные разведения, чтобы убедиться в точности концентрации соединения.
- Распределите 0,25 мкл ингибиторов протеасом на пустые черные 384-луночные планшеты с плоским дном. Мы используем обработчик жидкостей, оснащенный 384-капиллярной головкой, способной перекачивать объемы.
- Затравка 1,5 х 1010⁴ клеток на лунку в 50 мкл DMEM Media на пробных планшетах. Инкубируйте пробирные планшеты при 37 °C и 5% CO₂ в течение 24 часов.
- Добавьте 10 μл среды DMEM (предварительно подогретой до 37 °C) с раствором для окрашивания (Hoechst 33342 в запасе 10 мг/мл) и выдерживайте при комнатной температуре в течение 10 минут.
- Запустите операционное программное обеспечение микроскопа. Скриншот экспериментальной установки показан на рисунке 4. Выберите вкладку «Конфигурация» и выберите объектив 20X и правильный тип пластины. Убедитесь, что «воротник» установлен на объективе на правильном значении, что позволяет правильно фокусироваться при использовании пластин разных типов.
- Выберите вкладку "Микроскоп". Определите экспозицию 1 как YFP (лазер 488) и экспозицию 2 как позицию Хёхста (лазер 405). Активируйте фильтр на обеих экспозициях и назначьте экспозицию 1 камере 1, а экспозицию 2 камере 2. Установите время экспозиции на ~800 мс для экспозиции 1 и ~40 мс для экспозиции 2.
- Выберите экспозицию 1. Установите высоту фокусировки на 0 мкм. Выберите «Фокус». После фокусировки экспонируйте камеру 1. Отрегулируйте высоту фокусировки для оптимизации плоскости экспозиции и нажмите на кнопку "Take height". Изменяйте время экспозиции и мощность лазера, чтобы получить максимальную интенсивность пикселей ~3,000. Сохраните параметры экспозиции. Повторите для экспозиции 2.
- Выберите вкладку «Определение эксперимента». Создайте макет и вложенный макет. Перетащите соответствующий макет, экспозицию, эталонное изображение, файл неравномерной обрезки и подмакет. Сохраните эксперимент.
- Выберите вкладку "Автоматический эксперимент" и получите изображения. В конце каждого прогона отснятые изображения автоматически загружаются на сервер.
6. Анализ изображений двух каналов
- Выберите программный алгоритм для сегментации первичных объектов (ядер, цитозоля и агрегатов) (рис. 5).
- Выберите метод, который точно сегментирует ядра путем визуального осмотра сегментированных объектов. Для определения количества ячеек будут использоваться объекты, окрашенные методом Хёхста в канале 1 (Ch1). Окрашивание YFP от мутантного SOD1-A4V в канале 2 (Ch2) будет использовано для определения количества агрегатов.
- Подсчитайте клетки с помощью алгоритма «найти ядра» как области окрашивания по методу Хёхста >20 мкм² с коэффициентом расщепления 7,0, индивидуальным порогом 0,40 и контрастом >0,10.
- Создайте таблицу данных и определите EC50 для каждого из соединений с помощью уравнения «Нелинейная регрессия» в программном обеспечении для построения графиков.
