Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были проверены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Анализ активности эндотоксинов (EAA)
- Соберите образцы крови пациента в стерильные пробирки, содержащие антикоагулянт ЭДТА. Хранение образцов крови при комнатной температуре
- Подготовьте пробирки EA для каждого образца крови пациента, который вам необходимо проверить. Поместите трубки в штативы для трубок. Затем снимите крышки.
- Каждый тест EA состоит из 5 различных видов пробирок; используйте каждую из них для отдельной части теста (см. следующие шаги).
- С помощью пробирки #1 (пробирка «Контроль») можно измерить базальную активность неспецифического окислительного взрыва нейтрофилов пациента в отсутствие специфического антитела.
- Используйте пробирку #2 (пробирка «Образец») для измерения окислительного взрыва в ответ на комплекс липополисахарид (ЛПС)-антитело.
- С помощью пробирки #3 (пробирка "Max") можно измерить максимальный окислительный всплеск нейтрофилов пациента в ответ на избыток эндотоксина.
- Используйте пробирку #4 (пробирка «ЛПС») в качестве источника экзогенного эндотоксина.
- Используйте пробирку #5 (пробирка "Aliquot") для хранения крови.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дубликаты пробирок #1, #2 и #3 предоставляются для использования в общей сложности 8 пробирок для каждого исследуемого образца крови (флакон с реагентом EA и тест контроля качества могут быть использованы для всех тестов, содержащихся в пакете).
- С помощью комбинированной пипетки наберите объем 1 мл реагента EA из флакона в пробирки #1 (контрольная пробирка), #2 (пробирка для образца) и #3 (максимальная пробирка), каждая в двух экземплярах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите пипеткой вниз по боковой стороне пробирки, чтобы избежать повторного разбрызгивания раствора.
- Перемешайте образец крови пациента, осторожно перевернув пробирку для сбора крови 20 раз. Затем пипетка 0,5 мл крови пациента в пробирку #4 (пробирка LPS max) и пробирку #5 (пробирка Aliquot). Вихревая трубка #4 на 10 с.
- Поместите штативы для пробирок со всеми пробирками EA в шейкер инкубатора. Закрыть крышкой и выдерживать 10 минут при температуре 37°C.
- Откройте крышку и извлеките штативы для пробирок из шейкера инкубатора. Вихревая трубка #5 (Аликвотная трубка). С помощью стерильного наконечника пипеткой нанесите 40 мкл крови в пробирки #1 и #2, в двух экземплярах.
- Вихревая трубка #4 (LPS tube). С помощью того же наконечника пипетки нанесите 40 мкл крови из пробирки #4 в пробирку #3 (пробирка Max), в двух экземплярах.
- Переведите шесть последних пробирок (#1, #2, #3 и соответствующие дубликаты), затем поместите их обратно в штативы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все трубки находятся в состоянии завихрения в течение одинакового времени.
- Поместите штативы для пробирок обратно в инкубационный шейкер и закройте крышку. Установите инкубационный шейкер на 100 оборотов в минуту, затем начните движение в течение 14 минут.
- Вставьте чип-карту с маркировкой EA в хемилюминометр и нажмите «Пуск». После 14-минутной инкубации следуйте инструкциям, отображаемым на хемилюминометре, чтобы считывать показания пробирок EA в правильном порядке.
Аккуратно перебейте - каждую пробирку на 10 секунд, прежде чем поместить ее на держатель образца хемилюминометра. Откройте ящик для образцов и поместите пробирку #1 в держатель для образцов. Затем закройте ящик с образцами и дождитесь показаний относительной единицы света (RLU).
- Повторите шаг 1.12 для трубки 2 и трубки 3.
- Повторите шаг 1.12 для дубликатов трубок 1, 2 и 3.
заметка: Попробуйте сделать вихревыми движениями все трубки на одинаковое количество времени во время шагов 1.12–1.14.
- После того, как все трубки будут обработаны, обратите внимание, что результаты советника будут рассчитаны и напечатаны автоматически. Уровни выражаются в единицах EA и представляют собой среднее значение повторяющихся определений из одних и тех же образцов.
- Повторите шаги с 1.4 по 1.15 для каждого образца крови, который необходимо исследовать.
- После завершения анализа храните оставшиеся пробирки и реагенты EA при температуре 2–8 °C в течение 30 дней.
